kub
Островок  здоровья

----
  
записная книжка врача акушера-гинеколога Маркун Татьяны Андреевны
----
 
 
 

Выделение и искусственный синтез белков

Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также для изучения их химического состава и строения непременным условием является получение белков из природных источников в химически индивидуальном гомогенном состоянии. Последовательность операций по выделению белков обычно сводится к

  • Гомогенизации биологического материала (измельчению) [показать]
  • Экстракция белков (извлечению) [показать]
  • Фракционировании белков (разделении смеси белков) - проводится после достижения полной экстракции белков, т. е. перевода белков в растворенное состояние [показать]

    Белковые вещества весьма чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов (органических растворителей, кислот, щелочей), поэтому обычные методы органической химии, применяемые для изолирования того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, кристаллизация и др.), в данном случае неприемлемы. Белки в этих условиях теряют некоторые весьма существенные природные (нативные) свойства, в частности растворимость, биологическую активность, подвергаясь денатурации. Были разработаны эффективные методы выделения белков в мягких условиях, при низкой температуре (не более 4 °С), с применением щадящих нативную структуру химических реагентов.

    Методы разделения смеси белков:

    • Высаливание [показать]
    • Хроматография [показать]
      • Адсорбционная хроматография [показать]
      • Распределительная хроматография [показать]
      • Ионообменная хроматография [показать]
      • Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) [показать]
      • Гель-хроматография [показать]
    • Электрофорез [показать]
  • Очистке белков (выделению) и получению индивидуального белка [показать]

Выбор методов выделения и очистки белка основывается на его свойствах. (см. табл. 1 [показать])

Определение гомогенности белков

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если белок движется при диск-электрофорезе в виде одной узкой полосы и если в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая и т. д.), то эти данные с большой долей вероятности могут свидетельствовать об однородности исследуемого белка. Для строгого доказательства гомогенности белка требуется одновременное использование нескольких методов.

В основе иммунохимического метода контроля гомогенности исследуемого белка лежит реакция преципитации его с соответствующей антисывороткой, полученной от иммунизированных этим белком животных.

Не потерял своего значения и метод определения растворимости белка. Этот метод, предложенный еще Д. Нортропом (и лаборатории Нортропа в 1930-1931 гг. впервые получены в химически индивидуальном и кристаллическом состоянии пепсин, химотрипсин и трипсин), основан на правиле фаз Гиббса, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от количества вещества, находящегося в твердой фазе. Метод может быть выполнен сравнительно легко и быстро в микромасштабах. Обычно определяют растворимость увеличивающегося количества исследуемого белка при постоянном количестве растворителя.

Методы изучения структуры белка. После выделения гомогенного белка исследуют его структурную организацию (первичную, вторичную, третичную и четвертичную). Основные методы и приемы, используемые для изучения структуры белков, перечислены в табл. 2. Как правило, для получения возможно более полной информации о высших уровнях структурной организации белков используют несколько разных методов.

Таблица 2. Некоторые методы изучения разных уровней структурной организации белка
Структура белка Метод изучения Цель метода
Первичная Гидролиз (кислотный, щелочной, ферментативный)

Ионообменная хроматография на анализаторе аминокислот

Сиквенация (на приборах сиквенаторах)

Разрыв пептидных связей и получение смеси аминокислот

Определение аминокислотного состава путем разделения аминокислот, основанного на различиях в их кислотно-основных свойствах

Установление порядка чередования аминокислот путем автоматического последовательного отсечения аминокислот от полипептидной цепи и их идентификации

Вторичная Спектрополяриметрия (измерение угла вращения плоскополяризованного света на спектрополяриметрах) Обнаружение регулярных структур α-спиралей и β-структур. Метод основан на способности аминокислотных остатков полипептидной цепи вращать плоскость поляризованного света влево. Находясь в виде беспорядочного клубка, белок вращает плоскость тоже влево. α-Спирали и β-структуры вращают плоскость поляризации света вправо. Чем больше степень регулярных структур (α- и β-структур) в белке, тем больше выражено правое, вращение
Метод изотопного обмена Установление степени спирализaции белка (количества α-спиралей). Метод основан на определении медленно обменивающегося водорода иминных групп пептидных связей на дейтерий тяжелой воды (D2О). Медленно обменивается водород пептидных связей в том случае, если он участвует в образовании межпептидных водородных связей. Чем больше медленно обменивающегося водорода белка, тем выше степень спирализации
УФ спектрофотометрия (измерение степени поглощения белков при 190 нм на спектрофотометрах) Определение степени спирализации белков (количества α-спиралей). Метод основан на гипохромном эффекте, т. е. пониженном поглощении света при 190 нм белком, находящимся в спирализованном состоянии, но сравнению с аморфным (беспорядочный клубок). (При 190 нм максимум поглощения пептидных групп.) По наличию гипохромного эффекта можно судить о степени спирализации белка: чем он выраженнее, тем выше спирализация
ИК спектроскопия (измерение спектра поглощения белков в инфракрасной области на инфракрасных спектрофотометрах) Установление наличия регулярных структур в белке по ориентации относительно оси макромолекулы групп -NН- и С=О пептидных связей. Метод основан на измерении разности поглощения ИК света, поляризованного вдоль и перпендикулярно оси ориентации молекулы белка
Третичная Электронная микроскопия Определение конфигурации белков и отдельных частей их молекул, например спиральных участков. Для повышения контрастности (электронной плотности) белков используют специальные покрытия, которые адсорбируются поверхностью белка. При облучении таких белков пучком электронов происходит их поглощение контрастирующими веществами (на пленке они темные), которые окружают белок и его структуры (на пленке они светлые)
Рентгеноструктурный анализ Установление пространственного расположения всех атомов в молекуле белка. Метод основан на дифракции рентгеновского излучения электронами, окружающими ядра атомов в кристалле белка, поскольку длина волны рентгеновского излучения соизмерима с межатомными расстояниями в кристалле белка. На фотопластинке, помещенной за кристаллом, рентгеновское излучение дает дифракционную картину, характерную для третичной структуры белка
Четвертичная Электронная микроскопияТо же, что и для установления третичной структуры
Рентгеноструктурный анализТо же
Электрофорез Установление наличия разных субъединиц в олигомере. Принцип основан на неодинаковой подвижности в электрическом поле олигомеров, состоящих из разных субъединиц, каждая из которых имеет свой заряд

Искусственный синтез белка. Очень трудоемкий процесс искусственного синтеза белка в настоящее время автоматизирован. Искусственный синтез позволяет получать белки, абсолютно идентичные белкам человека и не являющиеся чужеродными в отличие от аналогичных белков, выделенных из органов животных. При этом сохраняется дорогое природное сырье - тушки и органы животных. В настоящее время синтезированы короткие пептиды (окситоцин, вазопрессин, пептиды гипоталамуса) некоторые тропные белковые гормоны гипофиза - кортикотропин, соматотропин, инсулин и т. д., которые могут применяться как лекарственные средства. Выпуск некоторых из них осуществляется в промышленных масштабах.

Страница 1 2 3 4 5 6 7 всего страниц: 7




 
 

Куда пойти учиться



 

Виртуальные консультации

На нашем форуме вы можете задать вопросы о проблемах своего здоровья, получить поддержку и бесплатную профессиональную рекомендацию специалиста, найти новых знакомых и поговорить на волнующие вас темы. Это позволит вам сделать собственный выбор на основании полученных фактов.

Медицинский форум КОМПАС ЗДОРОВЬЯ

Обратите внимание! Диагностика и лечение виртуально не проводятся! Обсуждаются только возможные пути сохранения вашего здоровья.

Подробнее см. Правила форума  

Последние сообщения



Реальные консультации


Реальный консультативный прием ограничен.

Ранее обращавшиеся пациенты могут найти меня по известным им реквизитам.

Заметки на полях


навязывание услуг компании Билайн, воровство компании Билайн

Нажми на картинку -
узнай подробности!

Новости сайта

Ссылки на внешние страницы

20.05.12

Уважаемые пользователи!

Просьба сообщать о неработающих ссылках на внешние страницы, включая ссылки, не выводящие прямо на нужный материал, запрашивающие оплату, требующие личные данные и т.д. Для оперативности вы можете сделать это через форму отзыва, размещенную на каждой странице.
Ссылки будут заменены на рабочие или удалены.

Тема от 05.09.08 актуальна!

Остался неоцифрованным 3-й том МКБ. Желающие оказать помощь могут заявить об этом на нашем форуме

05.09.08
В настоящее время на сайте готовится полная HTML-версия МКБ-10 - Международной классификации болезней, 10-я редакция.

Желающие принять участие могут заявить об этом на нашем форуме

25.04.08
Уведомления об изменениях на сайте можно получить через раздел форума "Компас здоровья" - Библиотека сайта "Островок здоровья"

Островок здоровья

 
----
Чтобы сообщить об ошибке на данной странице, выделите текст мышью и нажмите Ctrl+Enter.
Выделенный текст будет отправлен редактору сайта.
----
 
Информация, представленная на данном сайте, предназначена исключительно для образовательных и научных целей,
не должна использоваться для самостоятельной диагностики и лечения, и не может служить заменой очной консультации врача.
Администрация сайта не несёт ответственности за результаты, полученные в ходе самолечения с использованием справочного материала сайта
Перепечатка материалов сайта разрешается при условии размещения активной ссылки на оригинальный материал.
© 2008 blizzard. Все права защищены и охраняются законом.



 
----