Предыдущая: Строение ферментов

Проблема структуры и функции ферментов, вопросы механизма их действия почти ежегодно подробно обсуждаются на многих международных симпозиумах и конгрессах. Важное место отводится рассмотрению структуры активных центров, конкретному механизму действия различных типов ферментов, общей теории энзиматического катализа. До установления химической природы ферментов гипотезы о механизме действия ферментов опирались на исследования кинетики и на модельные опыты химического гомогенного катализа. Повышение скорости химических реакций под действием ферментов объясняли:

1. активированием субстрата в результате образования адсорбционных или молекулярных, обратимо диссоциирующих фермент-субстратных комплексов;
2. за счет цепных механизмов реакций с участием радикалов или возбужденных молекул, активированных "ударом 2-го порядка".

Оказалось, что цепные механизмы реакции не играют существенной роли в биологическом катализе. После установления химической природы ферментов подтвердилось представление, выдвинутое более 70 лет назад Арни, Михаэлисом и Ментен, о том, что при ферментативном энзиматическом катализе фермент соединяется (в принципе обратимо) со своим субстратом, образуя нестойкий промежуточный фермент-субстратный комплекс, который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продуктов реакции.

Михаэлис не только постулировал образование промежуточного фермент-субстратного (ЕS)-комплекса¹ (¹ В уравнениях реакций субстрат будет обозначаться символом S, фермент — Е, продукт реакции — Р.), но и рассчитал влияние концентрации субстрата на скорость реакции (см. ниже). В процессе реакции различают несколько стадий; присоединение молекулы субстрата к ферменту, преобразование первичного промежуточного соединения в один или несколько последовательных (переходных) комплексов и протекающее в одну или несколько стадий, отделение конечных продуктов реакции от фермента. Сказанное можно схематически проиллюстрировать следующими примерами:

E + S --> ES --> E + P

В реакциях анаболизма, допустим, А + В —> АВ, фермент может соединяться как с одним, так и с другим субстратом или обоими субстратами:

На рис. 43 представлена схема образования промежуточного фермент-субстратного комплекса. Если фермент в активном центре содержит кофермент, то предполагается образование тройного комплекса (рис. 44).

Поскольку фермент вступает во взаимодействие с субстратом на очень короткий период, долго не удавалось показать образование такого комплекса. Прямые доказательства существования фермент-субстратного комплекса были получены в лабораториях Кейлина и Чанса. В настоящее время экспериментальные и математические методы кинетики, термодинамики и статистической механики химических реакций позволяют определять для ряда ферментативных реакций кинетические и термодинамические показатели, в частности константы диссоциации промежуточных фермент-субстратных комплексов, константы скорости и равновесия их образования.

В образовании фермент-субстратных комплексов участвуют водородные связи, электростатические и гидрофобные взаимодействия, а также в ряде случаев ковалентные, координационные связи (примерная схема таких связей представлена на рис. 45). Информация о природе связей между субстратом и связывающим участком активного центра фермента может быть получена методами электронного парамагнитного и ядерно-магнитного резонанса (ЭПР и ЯМР), а также методами ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии. Для каталитической активности фермента существенное значение имеет пространственная структура, в которой жесткие участки α-спиралей чередуются с гибкими, эластичными линейными отрезками, обеспечивающими динамические изменения белковой молекулы фермента. Этим изменениям придается большое значение в некоторых теориях ферментативного катализа. Так, согласно гипотезе "индуцированного", или "вынужденного", контакта Кошленда, каталитически активная конфигурация молекулы фермента и соответственно активного центра может в определенных случаях возникать лишь в момент присоединения субстрата в результате его деформирующего воздействия. Подобная деформация может быть представлена в виде схемы (рис. 46). Видно, что присоединение субстрата (S) к ферменту (Е), вызывая соответствующие изменения конформации активного центра, в одних случаях приводит к образованию активного комплекса (1), в других — к образованию неактивного комплекса (2) из-за нарушения пространственного расположения функциональных групп активного центра в промежуточном комплексе.

В каталитическом процессе существенное значение имеют точное соответствие между ферментом и субстратом, а также термодинамические и каталитические преимущества подобного соответствия. Гипотеза "соответствия" предполагает существование между ферментом и субстратом не только пространственной или геометрической комплементарности, но и электростатического соответствия, обусловленного спариванием противоположно заряженных групп субстрата и активного центра фермента. Эта гипотеза не отрицает и участия всей молекулы фермента, которая, вероятнее всего, определяет более узкую субстратную специфичность. Точное соответствие обеспечивает образование эффективного комплекса между субстратом и ферментом.

Подобно другим катализаторам, ферменты, с термодинамической точки зрения, ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации¹. Энергией активации называется энергия, необходимая для перевода всех молекул моля вещества в активированное состояние при данной температуре. Другими словами, это энергия, необходимая для запуска химической реакции, без которой реакция не начинается, несмотря на ее термодинамическую вероятность. Фермент снижает энергию активации путем увеличения числа активированных молекул, которые становятся реакционно-способными на более низком энергетическом уровне (рис. 47). Как видно из рис. 47, ферментативная реакция имеет более низкую энергию активации. Следует отметить, что как катализируемая ферментом, так и не катализируемая им реакция независимо от ее пути имеет одинаковую величину стандартного изменения свободной энергии (ΔG¹). (¹ Величину энергии активации обычно выражают в джоулях на моль (Дж/моль).)

Зависимость между константой равновесия и изменением свободной энергии реагирующих веществ математически принято выражать формулой: ΔG = -R · T · lnК, где R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура; ln К — натуральный логарифм константы равновесия; ΔG — стандартное изменение свободной энергии, т. е. уменьшение или увеличение свободной энергии в калориях при превращении 1 моль (1 грамм-молекулы) реагирующего вещества в 1 моль продукта. Из представленного уравнения вытекает, что при высоком значении К величина ΔG оказывается отрицательной. Подобные реакции сопровождаются уменьшением свободной энергии. При низком значении К величина ΔG оказывается положительной. Если константа равновесия равна единице, изменение свободной энергии будет равно нулю и реакция является легко обратимой. Для измерения константы равновесия и величины свободной энергии какой-либо химической реакции, например реакции взаимопревращения глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат (см. Химия и обмен углеводов), катализируемой ферментом фосфоглюкомутазой, определяют количество глюкозо-6-фосфата и количество глюкозо-1-фосфата при достижении химического равновесия. В состоянии равновесия количество глюкозо-6-фосфата оказывается в 19 раз больше количества глюкозо-1-фосфата. Отсюда константа равновесия К равна 19. Подставляя эту цифру в уравнение ΔG = —R · T · lnК, получаем: ΔG = —7329 Дж/моль. Это означает, что при превращении 1 моль глюкозо-1-фосфата в 1 моль глюкозо-6-фосфата при 25°С происходит уменьшение свободной энергии системы на 7329 Дж.

Таким образом, в механизме ферментативного катализа ведущую роль играют промежуточные фермент-субстратные комплексы, образование которых определяется тонкой структурой активного и эффекторного центров и уникальной структурой всей молекулы фермента, обеспечивающими высокую каталитическую активность и специфичность действия биокатализаторов.

Кинетика ферментативных реакций

Одним из характерных проявлений жизни является удивительная способность живых организмов кинетически регулировать химические реакции, подавляя стремление к достижению термодинамических равновесий [Малер Г., Кордес Ю., 1970]. Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (фермента, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрации, pH среды, температуры, присутствия активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, которая может способствовать пониманию механизма действия фермента.

Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. Известно, что любая химическая реакция характеризуется константой термодинамического равновесия. Она выражает состояние химического равновесия, достигаемого системой, и обозначается K_eq. Так, для реакции:

константа равновесия равна произведению концентраций образующихся веществ, деленному на произведение концентраций исходных веществ. Значение константы равновесия обычно находят из соотношения констант скоростей прямой (r₊₁) и обратной (r_-1)реакций, т. е. K_eq = r₊₁/r_-1. В состоянии равновесия скорость прямой реакции: v₊₁ = r₊₁[A]·[B] равна скорости обратной реакции: v_-1 = r_-1[C]·[D], т. е. v₊₁ = v_-1, соответственно,

Таким образом, константа равновесия равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакций. Величину, обратную константе равновесия (K_eq), принято называть субстратной константой, или, в случае ферментативной реакции, константой диссоциации фермент-субстратного комплекса, и обозначать символом K_s. Так, в реакции:

т. е. K_s равна отношению произведения концентрации фермента и субстрата к концентрации фермент-субстратного комплекса или отношению констант скоростей обратной и прямой реакций. Следует отметить, что константа K_s зависит от химической природы субстрата и фермента и определяет степень их сродства. Чем ниже значение K_s, тем выше сродство фермента к субстрату.

При изучении кинетики ферментативных реакций следует учитывать одну важную особенность этих реакций (не свойственную обычным химическим реакциям), связанную с явлением насыщения фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 48) является почти линейной и подчиняется кинетике 1-го порядка. Это означает, что скорость реакции S -—> Р прямо пропорциональна концентрации субстрата [S] и в любой момент времени (t) определяется следующим кинетическим уравнением:

где [S] — молярная кoнцентрация субстрата S; —d[S]/dt — скорость убыли субстрата; r' — константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность 1/время (мин^-1 или с^-1).

При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна и становится постоянной и не зависящей от концентрации субстрата [S]. В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка: V = r" (при полном насыщении фермента субстратом) и целиком определяется концентрацией фермента (см. ниже). Различают, кроме того, реакции 2-го порядка, скорость которых пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ. В определенных условиях при нарушении пропорциональности говорят о реакциях смешанного порядка (см. рис. 48).

Изучая явление насыщения, Михаэлис и Ментен разработали общую теорию ферментативной кинетики. Они исходили из предположения, что ферментативный процесс осуществляется в виде следующей химической реакции:

т. е. фермент Е вступает во взаимодействие с субстратом S с образованием промежуточного комплекса ES, который далее распадается на свободный фермент и продукт реакции Р. Математическая обработка на основе закона действующих масс дала возможность вывести уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса — Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции:

где v — наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации субстрата [S]; s — константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, моль/л; V_mах — максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом.

Из уравнения Михаэлиса-Ментен следует, что при высокой концентрации субстрата и низком значении K_s скорость реакции является максимальной, т. е. v = V_max (реакция нулевого порядка, см. рис. 48); при низкой концентрации субстрата (см. рис. 48), напротив, скорость реакции оказывается пропорциональной концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция 1-го порядка).

Однако следует указать, что уравнение Михаэлиса — Ментен в его классическом виде не учитывает влияния на скорость ферментативного процесса продуктов реакции, например в реакции:

и носит несколько ограниченный характер. Поэтому были предприняты попытки усовершенствования его. Так было предложено уравнение Бриггса — Холдейна:

где К_m представляет собой константу Михаэлиса, являющуюся экспериментально определяемой величиной. Она может быть представлена следующим уравнением:

В числителе представлены константы скоростей распада комплекса ES в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в сторону конечных продуктов реакции Е и Р). Отношение r_-1/r₊₁ представляет собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса K_s (см. выше).

если r-1 = Ks , то Km = Ks + r+2 r+1 r+1

Отсюда вытекает важное следствие, что константа Михаэлиса всегда больше, чем константа диссоциации фермент-субстратного комплекса K_s на величину r₊₂\r₊₁.

Для определения численного значения К_m обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v составляет половину от максимальной V_max; т. е. если v = 1/2V_max, то подставляя значение v в уравнение Бриггса-Холдейна, получаем: разделив обе части уравнения на V_max, имеем: или К_m + [S] = 2[S], откуда К_m = [S]

Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной¹. (¹ Экспериментальные значения К_m для большинства ферментативных реакций с участием одного субстрата лежат обычно в пределах 10^-2—10^-5 М.)

Определение величины К_m имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на активность ферментов и т. д. Константу Михаэлиса можно вычислить из графика, представленного на рис. 49. Отрезок на оси абсцисс, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять собой К_m.

Следует указать, что пользоваться графиком, построенным в прямых координатах концентрация субстрата [S₀] — начальная скорость реакции (v₀), неудобно, поскольку максимальная скорость (V_max) является в данном случае асимптотической величиной и определяется недостаточно точно.

Для более удобного графического представления экспериментальных данных Лайнуивер и Бэрк преобразовали уравнение Бриггса-Холдейна по методу двойных обратных величин, исходя из того принципа, что если существует равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные величины также будут равны. В частности,

если v = Vmax · [S] , то 1 = 1 = Km + [S] Km + [S] v Vmax · [S] / (Km + [S]) Vmax · [S]

или 1 = Km + [S] v Vmax · [S] Vmax · [S]

после преобразования получаем уравнение:

1	=	Km	+	1
v		Vmax · [S]		Vmax

которое получило название уравнения Лайнуивера-Бэрка. Это уравнение эквивалентно уравнению прямой линии: у = ах + b. Если теперь в соответствии с этим уравнением построить график в координатах 1/v и 1/[S], то получим прямую (рис. 50), тангенс угла наклона которой будет равен величине K_m/V_max; отрезок, отсекаемый прямой от оси ординат, представляет собой 1/V_max (обратную величину максимальной скорости); если продолжить прямую линию за ось ординат, тогда на оси абсцисс отсекается отрезок, соответствующий обратной величине константы Михаэлиса - 1/K_m (см. рис. 50). Следует подчеркнуть, что значение V_max, как и K_m, определяется более точно по сравнению с графиком, построенным в прямых координатах, при построении графика по методу двойных обратных величин, поэтому метод нашел широкое применение в современной энзимологии.

Продолжение: Основные свойства ферментов