Предыдущая: Понятие о ферментах

Ферменты — простые и сложные белки. Ранее было указано (см. Химия сложных белков), что в природе существуют как простые, так и сложные ферменты. Первые целиком представлены полипептидными цепями и при гидролизе распадаются исключительно на аминокислоты. Примерами такого рода ферментов (простых белков) являются гидролитические ферменты, в частности пепсин, трипсин, папаин, уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и др. Большинство природных ферментов относится к классу сложных белков, содержащих, помимо полипептидных цепей, какой-либо небелковый компонент, присутствие которого является существенным для энзиматической активности. Подобные кофакторы могут принимать различные формы и различаться по прочности связи с полипептидной цепью. Если константа диссоциации сложного фермента настолько мала, что в растворе все полипептидные цепи оказываются связанными со своими кофакторами и не разделяются при выделении и очистке, то такой фермент получает название холофермента (холоэнзима), а кофактор — простетической группы, рассматривающейся как интегральная часть молекулы фермента. Полипептидную часть фермента принято называть апоферментом.

В литературе до сих пор употребляются и другие наименования компонентов сложных ферментов, в частности фермент-протеид, белковый компонент, кофермент. Под коферментом часто подразумевают дополнительную группу, легко отделяемую от апофермента при диссоциации. Предполагается, что между простетической группой и полипептидной цепью существует ковалентная связь, как, например, в молекуле ацетилкоэнзим-А-карбоксилазы, в которой кофактор биотин ковалентно связан с апоферментом посредством амидной связи (см. Витамины). С другой стороны, связи между кофакторами и пептидными цепями могут быть относительно слабыми (например, водородные связи или электростатические взаимодействия и др.). В таких случаях при выделении ферментов наблюдается полная диссоциация обеих частей и изолированный белковый компонент оказывается лишенным ферментативной активности, пока не будет добавлен извне недостающий кофактор. Именно к подобным изолированным низкомолекулярным органическим веществам, применим термин "кофермент", типичными представителями которых являются В₁-, В₂-, В₆-, РР-содержащие коферменты (см. Витамины). Известно также, что и простетические группы, и коферменты активно включаются в химические реакции, выполняя функции промежуточных переносчиков электронов, атомов водорода или различных групп, таких, как амино-, ацетильные-, карбоксильные группы.

Следует подчеркнуть, что разницу между простетической группой и коферментом нельзя абсолютизировать, поскольку в одних случаях, например у оксидазы D-аминокислот (см. ниже), кофактор, представленный флавинадениндинуклеотидом, может быть легко отделен от белковой части путем диализа. Тот же кофактор прочно связан ковалентно с ферментами тканевого дыхания, выполняя функции простетической группы.

Многие двухвалентные металлы (Mg²⁺, Мn²⁺, Са²⁺), как будет показано ниже, также выполняют роль кофакторов, хотя их не относят ни к коферментам, ни к простетическим группам. Однако имеется ряд примеров, когда ионы металлов прочно связаны с белковой молекулой, выполняя функции простетической группы. В частности, очищенный фермент, катализирующий окисление аскорбиновой кислоты (витамина С) в дезоксиаскорбиновую кислоту, содержит 8 атомов меди на молекулу; все они настолько прочно связаны с белковой молекулой, что даже не обмениваются ионообменными смолами и не отделяются путем диализа. Более того, методами электронного парамагнитного резонанса показано участие ионов меди в промежуточном переносе электронов. Интересно заметить, что ионы меди также наделены каталитической активностью при окислении аскорбиновой кислоты, однако активность повышается во многие тысячи раз, когда ионы меди соединяются с апоферментом в единый комплекс холофермента.

В табл. 15 приводятся данные о важнейших коферментах и простетических группах ферментов, включая их наименование, природу витамина, входящего в их состав, и характер производимой химической реакции. Химическая природа коферментов и химические реакции, катализируемые комплексом их с апоферментом, будут рассмотрены детально в разделе "Витамины".

Таблица 15. Важнейшие коферменты и простетические группы ферментов
Наименование (название)	Участвующий витамин	Группы, подлежащие переносу
Никотинамидадениндинуклеотид (НАД)	Никотинамид, витамин РР	Атомы водорода (электроны)
Никотинамидадениндинуклeотидфосфат (НАДФ)	Никотинамид, витамин РР	Атомы водорода (электроны)
Флавинмононуклеотид, рибофлавинфосфат (ФМН)	Рибофлавин, витамин В2	Атомы водорода (электроны)
Флавинадениндинуклеотид (ФАД)	Рибофлавин, витамин В2	Атомы водорода (электроны)
Коэнзим А (КоА)	B3 (пантотеновая кислота)	Ацильные, ацетильные и другие группы
Тетрагидрофолиевая кислота (ТГФ)	Bc (фолиевая кислота)	Метальные, метиленовые, формильные группы или фориминогруппы (одноуглеродные остатки)
Биоцитин	Биотин, витамин Н	Двуокись углерода (активная форма СO2)
Тиаминдифосфат (ТДФ)	Тиамин, витамин B1	Альдегиды и кетоны
Пиридоксальфосфат (ПФ)	Пиридоксин, витамин В6	Аминогруппы
		Карбоксильные группы
		Карбоксильные группы1 1Реакции отщепления (элиминирования) и конденсации в боковых цепях аминокислот
Дезоксиаденозил- и (метил)-кобаламин (В12-коферменты)	Цианкобаламин, витамин В12	Реакции изомеризации и перемещения метильных групп
Убихинон (коэнзим Q)	Витамин Q (убихинон)	Атомы водорода, протоны и электроны

Получены доказательства кофакторной функции в ферментативных реакциях ряда биологически активных соединений, не относящихся к витаминам: HS-глутатиона, АТФ, липоевой кислоты, производных нуклеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат), порфиринсодержащих веществ и др. Сюда же могут быть отнесены тРНК, которые в составе фермента аминоацил-тРНК-синтетазы принимают активное участие в переносе аминокислоте рибосомы, где осуществляется синтез белка (см. Биосинтез белка).

Следует отметить одну отличительную особенность двухкомпонентных ферментов, заключающуюся в том, что ни кофактор отдельно (включая кофермент), ни сам по себе апофермент каталитической активностью не обладают, и только их объединение, в единое целое, протекающее не хаотично, а в соответствии с программой их структурной (трехмерной) организации, обеспечивает быстрое протекание химической реакции.

Активный центр ферментов. При изучении механизма химической реакции, катализируемой ферментами, исследователя всегда интересует не только определение промежуточных и конечных продуктов и выяснение отдельных стадий реакции, но и природа тех функциональных групп в молекуле фермента, которые обеспечивают специфичность действия фермента на данный субстрат (или субстраты) и высокую каталитическую активность. Речь идёт, следовательно, о точном знании геометрии и третичной структуры фермента, а также химической природы того участка (или участков) молекулы фермента, который обеспечивает высокую скорость каталитической реакции.

Так как участвующие в ферментативных реакциях молекулы субстратов чаще всего имеют небольшие размеры по сравнению с молекулами ферментов, было высказано предположение, что при образовании ферментсубстратных комплексов в непосредственный контакт с молекулой субстрата, очевидно, вступает ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло представление об "активном центре" фермента. Под активным центром подразумевают уникальную комбинацию аминокислотных остатков в молекуле фермента, обеспечивающую непосредственное взаимодействие ее с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа (рис. 37). Установлено, что у ферментов-протеидов в состав активного центра входят также простетические группы.

В активном центре условно различают так называемый каталитический участок, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом, и "контактную" (или якорную) площадку, которая обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом. В свою очередь молекула субстрата также содержит функционально различные участки, например при действии эстераз или протеиназ - одну специфическую связь (или группу атомов), подвергающуюся атаке со стороны фермента, и один или несколько участков, избирательно связываемых ферментом. Сказанное может быть представлено в следующей общей форме:

Получены экспериментальные доказательства наличия в активном центре химотрипсина двух остатков гистидина и остатка серина, схематически представленных в трехмерной структурной модели этого фермента (рис. 38). Выявление химической природы и вероятной топографии групп активного центра является проблемой первостепенной важности; она сводится к определению природы аминокислот, их последовательности и взаиморасположения в активном центре. Для идентификации аминокислотных остатков используют ряд приемов: применение специфических ингибиторов (см. ниже) ферментов (часто это субстратоподобные вещества или аналоги коферментов), методов мягкого (ограниченного) гидролиза в сочетании с химической модифицацией, включающей избирательное окисление, связывание, замещение остатков аминокислот и другие приемы.

При помощи методов ингибиторного анализа были сделаны попытки установить общность активных центров у ферментов, относящихся к разным группам. В частности, при применении диизопропилфторфосфата (ДФФ) (принадлежащего к типу так называемых "нервных ядов") имеет место полное выключение активного центра холинэстеразы — фермента, катализирующего гидролиз ацетилхолина на холин и уксусную кислоту. Оказалось, что этот ингибитор имеет близкое структурное сходство с ацетилхолином и подобно ему взамодействует с ОН-группой остатка серина в активном центре. Вызывая фосфорилирование серина в активном центре ряда других ферментов, ДФФ также инактивирует их действие.

Показано, кроме того, что ДФФ избирательно фосфорилирует в каждом чувствительном к нему ферменте только один остаток серина, наделенный функциональной активностью. Учитывая этот механизм действия ДФФ, сделаны попытки определения природы аминокислот в окружении "каталитического" остатка серина у ряда ферментов. Полученные в этих исследованиях результаты суммированы в табл. 16.

Из табл. 16 видно, что ферменты, сходные по типу действия, хотя и различаются специфичностью, могут иметь почти одинаковую последовательность аминокислот в тех участках, которое примыкают к остатку серина, несущему функционально-активную гидроксильную группу. Существенное значение этой группы серина для акта катализа было доказано, кроме того, химическим ее блокированием или удалением, когда эстеразы полностью лишались ферментативной активности.

Предполагается, что формирование активного центра фермента начинается уже на ранних этапах синтеза белка-фермента (см. Биосинтез белка) на рибосоме, когда линейная одномерная структура пептидной цепи превращается в трехмерное тело строго определенной конфигурации.

Образовавшийся белок приобретает функциональную (в частности, каталитическую) информацию. Любые воздействия, приводящие к денатурации, т. е. к нарушению третичной структуры, приводят к искажению или разрушению структуры активного центра и соответственно к потере ферментом каталитических свойств. Если при подходящих внешних условиях удается восстановить нативную трехмерную структуру белка-фермента (ренатурировать его), то восстанавливается и его каталитическая активность. Это было показано впервые на примере рибонуклеазы поджелудочной железы.

Помимо активного центра, в молекуле фермента может присутствовать также аллостерический центр (или центры) (от греч. аллос — другой, иной и стереос — пространственный, структурный), представляющий собой участок молекулы фермента, с которым связываются определенные, обычно низкомолекулярные вещества (называемые эффекторами или модификаторами), молекулы которых не сходны по строению с субстратами. Присоединение эффектора к аллостерическому центру приводит к изменению третичной и часто также четвертичной структуры молекулы фермента и соответственно конфигурации активного центра, вызывая снижение или повышение энзиматической активности. Ферменты, активность которых контролируется состоянием как активного, так и аллостерического центра, получили название аллостерических ферментов¹.

¹ Ряд авторов рекомендуют пользоваться термином регуляторный центр (регуляторный фермент) вместо аллостерического для ферментов, обладающих регуляторными функциями, поскольку в этом случае якобы отпадает необходимость уточнения наличия на поверхности фермента особого центра для связывания эффектора.

Отличительной особенностью аллостерических ферментов является наличие в молекуле олигомерного фермента нескольких активных центров и нескольких аллостерических регуляторных центров, пространственно удаленных друг от друга. Аллостерический фермент может быть представлен в виде схемы (рис. 39), в которой каждый из двух симметрично построенных протомеров содержит активный центр, связывающий субстрат (S), и один аллостерический центр, связывающий эффектор (М₂). Получены доказательства, что аллостерические ферменты, помимо активного центра для субстрата, содержат так называемые эффекторные центры для него же; и хотя при связывании с эффекторным центром субстрат не подвергается каталитическому превращению, однако он влияет на каталитическую эффективность активного центра. Подобные взаимодействия между центрами, связывающими лиганды одного сорта, принято обозначать гомотропными взаимодействиями, а взаимодействия между центрами, связывающими лиганды разных сортов, — гетеротропными взаимодействиями.

ИЗОФЕРМЕНТЫ

В живой природе имеются ферменты, молекулы которых состоят из двух и более субъединиц, обладающих одинаковой или разной первичной, вторичной и третичной структурой. Выше (см. Химия белков) было указано, что субъединицы нередко называют протомерами, а объединенную олигомерную молекулу — мультимером. Схематически строение некоторых ферментов-мультимеров и способы связи протомеров представлены на рис. 40.

Следует прежде всего указать на отсутствие ковалентных, главновалентных связей между субъединицами. Связи между последними в основном являются нековалентными, поэтому такие ферменты довольно легко диссоциируют на протомеры. Удивительной особенностью таких ферментов является то, что активность всего комплекса зависит от способа упаковки между собой отдельных субъединиц. Если генетически различимые субъединицы могут существовать более чем в одной форме, то соответственно и фермент, образованный из двух или нескольких типов субъединиц, сочетающихся в разных количественных пропорциях, может существовать в виде нескольких сходных, но не одинаковых формах. Подобные разновидности фермента получили название изоферментов (изоэнзимов или, реже, изозимов). В частности, если фермент состоит из четырех субъединиц двух разных типов, например Н и М, активный фермент может представлять собой одну из следующих комбинаций: НННН, НННМ, ННММ, НМММ и ММММ, или соответственно Н₄, Н₃М, Н₂М₂, НМ₃, М₄.

Отметим также, что в одних случаях субъединицы имеют почти идентичную структуру и каждая из них содержит каталитически активный участок (например, β-галактозидаза, состоящая из 4 субъединиц). В других случаях субъединицы оказываются неидентичными. Примером последних может быть триптофансинтетаза, состоящая из двух субъединиц, каждая из которых наделена собственной энзиматической активностью. Однако, только будучи объединенными в макромолекулярную структуру, обе субъединицы проявляют триптофансинтетазную активность.

Термин множественные формы фермента применим к белкам, катализирующим одну и ту же реакцию, и встречающимся в природе в организмах одного вида. Термин изозим, или изоэнзим (изофeрмент), применим к тем множественным формам ферментов, которые появляются вследствие генетически обусловленных различий в первичной структуре белка, но не к формам, образовавшимся в результате модификации одной первичной последовательности.

Одним из наиболее изученных ферментов, множественность форм которого детально изучена методом гель-электрофореза (см. выше), является лактатдегидрогеназа, катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную (см. Обмен углеводов). Пять изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) образуются из 4 субъединиц примерно одинакового размера, но двух разных типов, условно обозначенных: Н-тип (от heart — сердце) и М-тип (от muscle — мышцы). Поскольку Н-протомеры несут более выраженный отрицательный заряд при pH 7,0—9,0, чем М-протомеры, изофермент, состоящий из 4 субъединиц Н-типов (Н₄), будет мигрировать при электрофорезе с наибольшей скоростью в электрическом поле к положительному электроду (аноду). С наименьшей скоростью будет двигаться к аноду изофермент М4, в то время как остальные изоферменты будут занимать промежуточные позиции. Типичную картину миграции изоферментов ЛДГ при электрофорезе схематически можно представить следующим образом (рис. 41).

Следует подчеркнуть, что изоферменты ЛДГ, обладая почти одинаковой ферментативной активностью, отличаются по ряду физико-химических свойств: молекулярной массе, электрофоретической подвижности, отношению к активаторам и ингибиторам и др. Однако для каждой ткани в норме характерно свое соотношение форм (изоферментный спектр) ЛДГ. Например, в сердечной мышце преобладает Н₄, т. е. ЛДГ₅ а в скелетных мышцах и печени — М₄ (ЛДГ₅), как это видно из рис. 42. Эти обстоятельства широко используют в клинической практике, поскольку изучение картины изоферментов ЛДГ (и ряда других ферментов) в сыворотке крови может представить интерес для дифференциальной диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей. По картине изоферментов сыворотки крови можно судить как о топографии патологического процесса, так и о степени поражения органа или ткани.

МУЛЬТИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ

Особую группу ферментов составляют надмолекулярные (или мультимолекулярные) ферментные комплексы, в состав которых входят не субъединицы, в каталитическом отношении однотипные протомеры, а разные ферменты, катализирующие последовательные ступени превращения какого-либо субстрата. Отличительной особенностью подобных мультиферментных комплексов является не только прочность ассоциации, но и определенная последовательность прохождения промежуточных стадий, продиктованная порядком расположения каталитически активных (различных) белков в пространстве ("путь" превращения в пространстве и времени). Типичными примерами подобных мультиферментных комплексов является пируватдегидрогеназа и α-кетоглутаратдегидрогеназа, катализирующие окислительное декарбоксилирование пировиноградной и α-кетоглутаровой кислот в животных тканях (см. Обмен углеводов), и синтетаза высших жирных кислот (см. Обмен липидов). Молекулярные массы этих комплексов в зависимости от источника их происхождения варьируют от 2,3·10⁶ до 10·10⁶ дальтон. Ассоциация отдельных ферментов в единый недиссоциирующий комплекс имеет определенный биологический смысл и ряд преимуществ. В частности, при этом резко сокращаются расстояния, на которые молекулы промежуточных веществ должны перемещаться при работе изолированных ферментов. Ряд таких мультиферментных комплексов структурно связан с какой-либо органеллой (рибосомы, митохондрии) или с биомембраной и составляет высокоорганизованные системы, обеспечивающие жизненно важные функции, например тканевое дыхание (перенос электронов от субстратов к кислороду через систему дыхательных ферментов).

Продолжение: Механизм действия ферментов