Предыдущая: Развитие представлений о биологическом окислении

Митохондрии содержатся в цитоплазме клетки и представляют собой микроскопические палочковидные или иной формы образования, количество которых в одной клетке составляет сотни или тысячи (например, в одной клетке печени крысы содержится около 1000 митохондрий). Для одного и того же типа клеток число митохондрий более или менее постоянно. Однако следует помнить, что количество митохондрий может меняться в зависимости от стадии развития клетки и ее функциональной активности.

Что же представляют собой митохондрии? Внутреннее пространство митохондрий окружено двумя непрерывными мембранами (рис. 75), причем наружная мембрана гладкая, а внутренняя образует многочисленные складки, или кристы. Внутри-митохондриальное пространство, ограниченное внутренней мембраной, заполнено так называемым матриксом, который примерно на 50% состоит из белка и имеет очень тонкую структуру. Размер митохондрий чаще равен 2-3 мкм в длину и около 1 мкм в ширину, однако удлиненную форму митохондрий не следует считать универсальной. В некоторых тканях, например в поперечнополосатых мышцах, митохондрии иногда принимают самые причудливые очертания. В митохондриях сосредоточено большое количество ферментов.

Наружная мембрана не содержит ни одного из компонентов цепи дыхательных катализаторов. С наружной мембраной связаны ферменты, участвующие в удлинении молекулы насыщенных жирных кислот, имеющих от 12 до 16 атомов углерода. Кроме того, в наружной мембране имеются кинуренингидроксилаза, моноаминоксидаза и некоторые другие ферменты. Моноаминоксидаза может служить маркерным ферментом для обнаружения наружной мембраны митохондрий. Следует заметить, что ряд ферментов наружной мембраны митохондрий напоминает ферменты мембран эндоплазматической сети. Исходя из ферментного набора наружной мембраны, пока трудно ответить на вопрос, в чем состоит ее назначение. Возможно, что наружная мембрана играет роль перегородки, отделяющей внутреннюю, рабочую, часть митохондрии от всего остального пространства клетки.

В межмембранном пространстве митохондрий обнаруживается активность аденилаткиназы (миокиназы) и нуклеозиддифосфаткиназы. Как уже отмечалось, с внутренней мембраной митохондрий связаны ферменты дыхательной цепи. Кроме того, она обладает АТФ-азной активностью, связанной с механизмом окислительного фосфорилирования, содержит сукцинатдегидрогеназу, β-гидроксибутиратдегидрогеназу, карнитинацил-трансферазу и ряд других ферментов. Важно отметить, что расположение сукцинатдегидрогеназы в непосредственной близости от других компонентов дыхательной цепи объясняет тот факт, что сукцинат окисляется в митохондриях намного быстрее, чем другие субстраты цикла трикарбоновых кислот. Маркерным ферментом для идентификации внутренней мембраны митохондрий служит цитохромоксидаза.

Матрикс содержит ряд ферментов цикла Кребса (цитрат-синтаза, изоцитратдегидрогеназа, фумараза, малатдегидрогеназа, аконитаза), ферменты, участвующие в β-окислении жирных кислот и синтезе мочевины, аспартатаминотрансферазу, глутаматдегидрогеназу, фосфоенолпируваткарбоксикиназу и др. Определение глутаматдегидрогеназы и малатдегидрогеназы часто используют для идентификации матрикса митохондрий.

Чрезвычайно важной функцией цепи дыхательных катализаторов, связанных с внутренней мембраной митохондрий, наряду с переброской электронов от субстратов дыхания на кислород, является аккумуляция части освобождающейся энергии (около 50%) в фосфатных связях высокоэргических (или макроэргических) соединений (главным образом АТФ).

Процесс сопряжения тканевого дыхания и фосфорилирования получил название окислительного фосфорилирования. Впервые в начале 30-х годов В. А. Энгельгардт высказал соображение о наличии сопряжения между фосфорилированием АДФ и аэробным дыханием. Позже, в 1940 г., В. А. Белицер и Е. Т. Цыбакова показали, что синтез АТФ из АДФ и Н₃РО₄ осуществляется в митохондриях при миграции электронов от субстрата к кислороду через цепь дыхательных катализаторов. При этом указанные авторы обнаружили, что отношение P/О, т. е. число молекул неорганического фосфата, перешедших в органическую форму (АТФ), в расчете на каждый поглощенный атом кислорода близко к 3.

Установлено, что уменьшение свободной энергии системы при переносе пары электронных эквивалентов от НАДН₂ к молекулярному кислороду составляет 220 кДж (52,7 ккал). В свою очередь величина стандартной свободной энергии образования АТФ из АДФ и Н₃РО₄ (АДФ + Н₃РО₄ --> АТФ + Н₂О) находится в пределах 30,2 кДж, или +7,3 ккал (по-видимому, в условиях in vivo эта величина около 34,5 кДж). Следовательно, уменьшение свободной энергии при переносе одной пары электронов от НАДН₂ к кислороду способно обеспечить синтез нескольких молекул АТФ из АДФ и фосфата. В табл. 25 приведены некоторые данные об энергетических взаимоотношениях в пределах отдельных фрагментов дыхательной цепи.

Как видно из табл. 25, на трех участках дыхательной цепи в митохондриях in situ выделяется достаточно энергии для образования одной молекулы АТФ из АДФ и фосфата.

На основании термодинамических данных была предсказана локализация трех пунктов фосфорилировання в дыхательной цепи (рис. 76).

Опыты с применением ингибиторов (ротенон, амитал, антимицин А, цианид) ферментов дыхательной цепи подтвердили эти предположения.

Известно также, что интенсивность дыхания управляется отношением АТФ/АДФ. Чем меньше это отношение, тем интенсивнее идет дыхание, обеспечивая выработку АТФ. Изменение скорости дыхания с изменением концентрации АДФ носит название дыхательного контроля.

ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

Окончательного ответа на вопрос о механизме сопряжения важнейших биоэнергетических процессов в митохондриях - дыхания и фосфорилирования - в настоящее время пока нет. Выдвинуты и обсуждаются три гипотезы: химическая, механо-химическая и химиоосмотическая.

Химическая гипотеза - наиболее ранняя гипотеза окислительного фосфорилирования (Липман; Слейтер и др.). Сущность ее состоит в предположении, что энергия, выделяющаяся при переносе электронов по дыхательной цепи, сначала используется для образования богатых энергией гийотетических соединений, а затем передается для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата. В схематической форме последовательность реакций можно представить следующим образом:

Однако, несмотря на многочисленные попытки, пока не удалось выделить, а следовательно, и охарактеризовать эти неизвестные посредники.

Механохимическая, или конформационная, гипотеза окислительного фосфорилирования Бойера (1964) основана на предположении, что взаимосвязь окисления и фосфорилирования обусловлена посредством конформационных изменений ферментов сопряжения. Высказываются соображения, что энергия окисления затрачивается на создание напряженной конформации фермента ("сокращение" фермента). Последующее возвращение в исходную конформацию ("расслабление") сопровождается использованием накопленной энергии для синтеза высокоэнергетического соединения, например тиоэфира, образованного в результате реакции между сульфгидрильной и карбоксильной группами ферментного белка. Затем происходит перенос энергии на АДФ. Однако следует заметить, что прямых доказательств справедливости данной гипотезы тоже нет, так как нельзя считать убедительными ссылки на наблюдения, касающиеся конформационных изменений дыхательных ферментов при переносе электронов. Такие изменения сопутствуют "работе" очень многих ферментов и поэтому не могут быть отнесены к специфическим свойствам ферментов сопряжения.

Химиоосмотическая гипотеза, предложенная в 1961 г. Митчеллом, приобретает в последние годы все больше сторонников. Следует отметить, что экспериментальное обоснование и дальнейшее развитие этой гипотезы во многом обязаны исследованиям В. П. Скулачева (1972) и др. Суть этой гипотезы состоит в предположении, что дыхание и фосфорилирование связаны между собой через электрохимический потенциал ионов водорода на митохондриальной мембране. Митохондриальная мембрана непроницаема для ионов Н⁺ и ОН^-. В процессе переноса электронов вдоль дыхательной цепи на наружной поверхности мембраны создается градиент концентрации ионов водорода¹. (¹По-видимому, определенные компоненты дыхательной цепи, соответствующим образом расположенные в плоскости мембраны, присоединяя электрон, могут захватывать также ион Н+ из матрикса и соответственно, отдавая электрон, освобождать ион Н⁺ только в водное пространство снаружи мембраны.) Предполагается, что на каждую пару электронов, переносимую вдоль дыхательной цепи от НАДН₂ к кислороду, приходятся три пары ионов Н⁺, извлекаемых из внутреннего матрикса и передаваемых при помощи компонентов дыхательной цепи в наружную среду (рис. 77). При этом наружная поверхность мембраны приобретает положительный заряд, а внутренняя - отрицательный (высокое содержание ионов ОН^-).

Накопление ионов Н⁺ и ОН^- на противоположных сторонах мембраны может вызвать обратную реакцию фермента АТФ-азы (АДФ + Фн --> АТФ + Н₂О), локализованного во внутренней мембране митохондрий. Эта реакция может протекать с высокой скоростью только при условии, если образующаяся вода будет быстро и полностью удаляться. Сторонники химиоосмотической гипотезы считают, что молекула воды отделяется от АДФ и Фн в виде ионов Н⁺ и ОН^-. В свою очередь наличие градиента концентрации ионов Н⁺ снаружи мембраны обусловливает "вытягивание" ионоа ОН^- во внешнюю среду с образованием воды, а высокая концентрация ионов ОН^- внутри митохондрии способствует "вытягиванию" ионов Н⁺, образующихся в обратной реакции, во внутреннее пространство митохондрии, и опять-таки с образованием воды.

Таким образом, можно предполагать, что тканевое дыхание заряжает митохондриальную мембрану, а окислительное фосфорилирование разряжает ее, используя энергию мембранного потенциала для синтеза АТФ. В целом гипотеза Митчелла, по-видимому, является наиболее обоснованной. Однако нетрудно видеть, что в современной теории биологического окисления и сопряженного с ним фосфорилировання имеется еще ряд пробелов и вопросов, требующих дальнейшего разрешения.

Помимо дыхания, связанного с фосфорилированием, протекающего в митохондриях, существует дыхание, не связанное с накоплением макроэргов. Это так называемое свободное, или нефосфорилирующее, окисление. Такой вид биологического окисления также связан с митохондриями, но освобождающаяся при этом энергия рассеивается в виде тепла. Следует помнить, что существует ряд соединений, способных разрывать сопряженность между дыханием и фосфорилированием. В частности, к таким разобщающим агентам относятся динитрофенол, дикумарин, тироксин и др.

МИКРОСОМАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ

Микросомальное окисление осуществляется ферментными системами, локализованными преимущественно в микросомной фракции таких органов, как печень и надпочечники. В отличие от митохондриального окисления, где ведущую роль, как было показано выше, играют реакции дегидрирования, а кислород является конечным акцептором электронов и используется лишь для образования воды, в процессах микросомального окисления активированный кислород непосредственно внедряется в окисляемое вещество. При этом функциональная роль митохондриального и микросомального окисления в клетке различна. Митохондриальное окисление - механизм использования кислорода в биоэнергетических процессах. Микросомальное окисление - механизм использования кислорода с "пластическими" целями.

Ферментные системы, локализованные в микросомной фракции и способные использовать молекулярный кислород для окисления специфических органических соединений, делятся на оксигеназы, присоединяющие оба атома кислорода (А + O₂ --> АO₂), и гидроксилазы, присоединяющие к субстрату только один из двух атомов O₂ (А + О₂ --> АОН + [O]). Второй атом кислорода используется обычно на окисление НАДФН₂. Например:

Микросомальная цепь ферментов, осуществляющая гидроксилирование, в значительной мере изучена. Она содержит цитохром Р-450, восстановленный СО-комплекс которого имеет максимум поглощения при длине волны 450 нм, специфический флавопротеид, включающий ФАД, и Fe-белок, содержащий негеминовое железо. Следует заметить, что флавопротеиды и цитохромы, которые функционируют в микросомальной цепи окисления, резко отличаются от ферментов митохондриальной дыхательной цепи.

На рис. 78 в общей форме представлена цепь переноса электронов в микросомах, при участии которой осуществляется гидроксилирование. Как видно из этого рисунка, имеются две точки цепи, где участвует НАДФН₂: первый раз он поставляет атом водорода и протон для образования воды, второй - отдает электрон для восстановления цитохрома Р-450 (в переносе электрона на цитохром участвуют флавопротеид и белок, содержащий негеминовое железо). Считается, что цитохром Р-450 выполняет двоякую функцию. Во-первых, он связывает субстрат гидроксилирования, во-вторых, на нем происходит активация молекулярного кислорода.

К числу эндогенных субстратов микросомального окисления следует отнести стероидные гормоны и холестерин, а также, по-видимому, ненасыщенные жирные кислоты. В последнее время появились указания на возможную роль реакций микросомальмого окисления в биосинтезе простагландинов. Велико значение микросомального окисления в метаболизме лекарственных средств и ряда токсических соединений.