В.В.Климов

Иммунофенотипирование: Проточная цитофлюорометрия

Эта технология применяется, главным образом, для быстрого определения клеточных субпопуляций в периферической крови, тканях и клеточных суспензиях. Она основана на связывании моноклональных антител, меченных флюорохромами, к поверхностным клеточным маркёрам, а также на учёте некоторых физических свойств клеток (размер, наличие гранул в цитоплазме, ядерно-цитоплазматическое соотношение). Это позволяет изучать клетки и молекулы в потоке капель при использовании источника лазерного света, генерирующего рассеянные лучи и флюоресцирующие пучки. Сначала предварительно меченные клетки идентифицируются в прямом рассеянном свете (что определяет размер клеток), затем под углом 90° (что выявляет наличие гранул), потом в флюоресцирующем свете (что даёт возможность верифицировать одновременно много маркёров). Более того, система позволяет сепарировать разные клетки в зависимости от их физических или специфических свойств.

Гейтирование - это сортировка и анализ данных в многоцветной проточной цитометрии на основе определения маркеров для интересующей популяции клеток.

(продолжение)

Эта технология (the flow cytofluorometry) широко используется, главным образом, для быстрого определения субпопуляций клеток в периферической крови, образцах ткани и клеточных суспензиях, и связывания гормонов и вирусов к рецепторам на поверхности клеток, измерения внутриклеточных компонентов (общей ДНК, новосинтезированной ДНК и т.д.) и процессов (апоптоз, мобилизация внутриклеточного кальция и др.). Метод основан на связывании меченных флюорохромами моноклональных антител к поверхностным маркёрам клеток и учёте некоторых физических свойств этих клеток (диаметр ядра и соответственно размер клетки, а также гранулярность) при пропускании через них лазерного излучения.

Лучи лазера трёх типов (двух рассеянных и одного флюоресцирующего) последовательно пропускаются через каждую клетку. Фотодетекторы преобразуют фотоны света в электронные сигналы, которые анализируются компьютером. Клетки отображаются на плотах - диаграммах, отображающих клеточные скопления с одинаковыми параметрами рассеивания света и спектра флюоресценции.

Сначала предварительно меченные моноклональными антителами с флюорохромами клетки пропускаются через рассеянный свет, направленный прямо, и рассеянный свет под углом 90°. Световые сигналы фокусируются с помощью линз в фотодиодной трубке на фотодетекторы, усиливаются и измеряются.

• Первый параметр, Forward Scatter Count (FSC), позволяет идентифицировать размер клетки (большой или маленький), а
• второй, Side Scatter Count (SSC), - даёт возможность определить наличие или отсутствие гранул в цитоплазме данной клетки.

Этих двух параметров бывает достаточно, чтобы отличить лимфоциты от моноцитов и полиморфно-ядерных лейкоцитов.

Затем с помощью иммунофлюоресценции устанавливается наличие или отсутствие антигенных маркёров на поверхности клетки, что позволяет отнести её к соответствующей субпопуляции. Для этих целей клетки, как указывалось выше, были предварительно мечены моноклональными антителами, конъюгированными c различными флюорохромами, которые имеют разный спектр флюоресценции. Например,

• fluorescein isothiocyanate (FITC) показывает зелёное свечение, а
• R-phycoerythrin (PE) - жёлто-оранжевое.

  Каждая клетка может быть помечена одновременно, по крайней мере, четырьмя маркерами.

Световые сигналы в многоскладчатых фототрубках (Photo Multiplier Tubes - PMT) фокусируются на фотодетекторы, усиливаются и регистрируются по отдельности как параметры Fluorescence Light (FL). Каждый параметр FL позволяет оценить содержание клеток, имеющих соответствующую метку и относящихся к соответствующей субпопуляции. Компьютер записывает информацию о тысячах клеток в одном образце, представляет её графически в виде плотов и распечатывает.

Более того, данная технология даёт возможность также на основе отличающихся физико-химических свойств сортировать и собирать различные клетки в отдельные пробирки.

Далее показана процедура измерения субпопуляций лимфоцитов, меченных антителами против CD3 (FITC), CD4 (PE) и CD8 (PE).

(окончание)

Правильное окрашивание клеток

Клетки ресуспензируются в концентрации 5 x 10⁶ кл./мл в изотоническом растворе (например, PBS), инкубируются с антителами, меченными флюорохромом и отмываются в соответствии с инструкцией производителя. Среда для цитометра (sheath fluid) фильтруется для удаления возможных частиц.

Выбор правильного вольтажа для детекторов FSC и SSC

Используя соответствующие количества клеток для детекторов FSC и SSC, необходимо выбрать правильные значения вольтажа так, чтобы клеточные популяции чётко различались на плоте (L - лимфоциты, M - моноциты, PMN -полиморфно-ядерные лейкоциты).

Выбор правильного вольтажа для детекторов FL

Используя соответствующие количества клеток для детекторов FL, необходимо выбрать правильный вольтаж таким образом, чтобы получить наилучшую позицию на плоте для субпопуляции, меченной каждым флюорохромом. Однако, выбор вольтажа должен сопровождаться отрицательным контролем на основе изотипа антител (см. ниже). После этого проверяется разграничение кластеров клеток, меченных одним из флюорохромов (например, anti-CD3 FITC и anti-CD8 PE), от неокрашенных клеток, которые не связывают антитела.

Контроль изотипа антител (isotype antibody control)

Чтобы отличить специфический сигнал фоюресценции от неспецифических сигналов рассеянного света (фон), может применяться контроль изотипа антител (например, IgG2a FITC и IgG2b PE). Антитела, применяемые для этого, должны быть идентичны по изотипу и флюорохрому тестируемым антителам.

Распределение компенсации

Если клетки мечены более, чем одним флюорохромом, используется компенсация.

Компенсация (сompensation) - это перенесение (вычитание) перекрывающих световых сигналов из показаний одного детектора FL на другой (FL1- %FL2 и наоборот). Например, компенсация позволяет удалить перекрывающие сигналы в оранжево-зелёном спектре таким образом, чтобы зелёная флюоресценция регистрировалась только на детекторе FL1, а оранжевая - только на FL2. С этой целью для клеток, меченных только anti-CD3 FITC, первоначально, в условиях ранее выбранного оптимального вольтажа для FL1, находится такая компенсация, чтобы на детекторе FL2 регистрировалась отрицательная FITC-флюоресценция. Если компенсация оптимальна, то медианы, проведённые через кластеры клеток, совпадают.

По аналогии с описанным выше, выбирается компенсация для клеток, меченных только anti-CD8 PE, так, чтобы отрицательная PE-флюоресценция наблюдалась на детекторе FL1.

Расчёт содержания клеток

Первоначально для каждой пары исследуемых антител (anti-CD3 FITC/anti-CD8 PE и anti-CD3 FITC/anti-CD4 PE) проводится контроль изотипа антител (IgG2a FITC и IgG2b PE). Если контроль отрицателен, можно определять квадранты на плоте для статистического анализа субпопуляций. Исследуемая субпопуляция может быть выделена двумя перпендикулярными линиями для любого желаемого статистического параметра.