Гейтирование (flow cytometry gating) - последовательная сортировка и анализ данных в многоцветной проточной цитометрии на основе выделения интересующих популяций клеток.

Обычно первоначально производится гейтирование по CD45 - общему маркёру лейкоцитов, затем выделяются все лимфоциты на основе прямого и бокового светорассеяния.

В последующем после двойного гейтирования по CD45 и лимфоцитарному региону проводится определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов, меченных разными флюорохромами для выявления отдельных интересующих маркеров клеток.

Фенотип и секреторная активность разных Т-клеток в ходе Т-клеточных иммунных ответов меняется в зависимости от стадии дифференцировки: наивные (включая недавних тимусных эмигрантов - RTE), активированные, эффекторные и клетки памяти. Эффекторные Т-лимфоциты считаются конечной стадией дифференцировки Т-клеток.

Классически для гейтирования могут использоваться следующие маркёры:

• CD45 - общий маркёр лейкоцитов
• CD27 - клеточная адгезивная молекула из суперсемейства рецепторов TNF, [показать] ответственная за выживание активированных Т-клеток или их апоптоз

  КЛЕТОЧНЫЕ АДГЕЗИВНЫЕ МОЛЕКУЛЫ

  Суперсемейство рецепторов TNF

  

  Рецепторы суперсемейства TNF (Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily) вовлечены в процесс регуляции апоптоза. Апоптоз играет решающую роль не только в эффекторных реакциях, но и при дифференцировке клеток. Молекулы семейства имеют структурную гомологию и представлены Fas (CD95), TNF-рецепторами I (CD120a) и II (CD120b), CD27, CD30, CD40, CD40L, CD257 и др.

• CD28 - костимуляторная молекула [показать]

  

  РЕГУЛЯЦИЯ ИММУННЫХ ОТВЕТОВ

  Костимуляторные/коингибиторные молекулы CD28, CTLA-4 и PD-1

  Нобелевская премия в 2018 г. была присуждена J.P. Allison (США) и T. Honjo (Япония) за их открытие метода противораковой терапии путём ингибирования негативной иммунорегуляции.

  

  При любом адаптивном иммунном ответе лимфоцит получает три типа сигналов для активации и последующей клональной экспансии:

  1. специфический сигнал от антигераспознающего рецептора/корецептора

     а также два неспецифических стимулов:
     

  2. от костимуляторных молекул
  3. от цитокинов

  При Т-клеточных ответах, костимуляторная молекула CD28 проводит позитивный сигнал Т-клеткам для их активации, а коингибиторные молекулы CTLA-4 (CD152) и PD-1 генерируют негативные иммуносупрессивные стимулы.

• CD62L - клеточная адгезивная молекула-селектин, [показать] ответственная за 1-ю фазу трансмиграции лейкоцитов через стенку сосуда

  КЛЕТОЧНЫЕ АДГЕЗИВНЫЕ МОЛЕКУЛЫ

  Семейство селектинов

  

  Молекулы селектинов (selectins) coстоят из нескольких доменов, трансмембранной области и цитоплазматического хвоста. Семейство представлено P- (тромбоцитарным), E- (эндотелиальным) и L- (лейкоцитарным) селектинами (CD62). Они отличаются по числу повторяющихся доменов и по экспрессии. С помощью лектиноподобного домена селектины связываются с сахарами на своих лигандах - муцинах (васкулярных аддрессинах) (см. ниже), что важно для начальной стадии миграции лейкоцитов через стенку сосудов.

  CD62Lиспользуется как один из главных маркёров способности клеток к экстравазации, что определяет функциональную принадлежность клеток и степень их зрелости. Наивные Т- и В-клетки экспрессируют CD62L, а эффекторные - нет.

  КЛЕТОЧНЫЕ АДГЕЗИВНЫЕ МОЛЕКУЛЫ

  Муциноподобные васкулярные аддрессины

  

  Mолекулы муцинов или васкулярных аддрессинов (vascular addressins), лигандов для селектинов, являются углеводы с гетерогенной структурой. Муцины имеют общую особенность – присутствие сиалила Lewis^x, ассоциированного с протеином. К муцинам относятся CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1 и др. Наряду с хемокинами, молекулы муцинов играют большую роль в хоминге клеток, особенно в высокие эндотелиальные венулы (high endothelial venules - HEV).

  Муцины со своими лигандами селектинами важны для начальной стадии (rolling) миграции лейкоцитов через стенку сосудов.

• CCR7 - хемокин, [показать] ответственный за миграцию клеток в лимфоидные органы (лимфатические узлы, селезёнку, МАЛТ)
  МОЛЕКУЛЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

  Гомеостатические и воспалительные хемокины

  

  Хемокины - специализированные цитокины, определяющие движение клеток. Имеется 4 подсемейства хемокинов, отличающиеся по положению в белковой цепи аминокислоты цистеина (С).

  Существует две группы хемокинов: гомеостатические, ответственные за хоминг клеток, и воспалительные, которые стимулируют движение клеток на сайты воспаления.

  Современная номенклатура хемокинов предполагает в названии хемокина наличие либо буквы L (Ligand) для самого хемокина, либо R (Receptor) - для рецептора, который использует какиой-либо хемокин, связываясь с клеткой. Один хемокин может связываться с несколькими рецепторами.

  Примеры гомеостатических хемокинов: CCL27 (cutaneous T-cell-attracting chemokine, CTACK), CCL28(mucosae-associated epithelial chemokine, MEC) и др.

  Примеры воспалительных хемокинов: CXCL8 (IL-8), CCL5 (RANTES), CCL11 (Eotaxin-1) и др.

  Примеры хемокиновых рецепторов: CCR7 - связывается с CCL19 (ELC) и CCL21 (SLC) для миграции во вторичные лимфоидные органы. Большинство рецепторов хемокинов сопряжены с G-белками.

• Цитокины,секретируемые клетками

Критерий	Наивные Т-клетки	Эффекторные Т-клетки	Центральные Т-клетки памяти	Эффекторные Т-клетки памяти
CD45 (маркёр лейкоцитов  и их зрелости с учётом  изоформ)	CD45RA+,  CD45RO-	CD45RA+,  CD45RO-	CD45RA-,  CD45RO+	CD45RA-,  CD45RO+
CD27 (защита от  апоптоза), CD28  (костимуляция)	CD27+, CD28+	CD27-, CD28-	CD27+, CD28+	CD27+, CD28+  (есть другие  варианты  экспрессии)
CD62L (экстравазация)	CD62L+	CD62L-	CD62L+	CD62L-
CCR7 (хоминг в  лимфоидные органы)	CCR7+	CCR7+	CCR7+	CCR7-
Цитокины (регуляторные  или эффекторные)	IL-2	IFN-γ, TNF-β	IL-2	IFN-γ, TNF-β

Данные, получаемые разными исследователями, иногда отличаются. Также следует отметить, что постепенно накапливается новые данные по гетерогенности Т-клеток на разных стадиях зрелости.