В репликации принимают участие следующие ферменты: 1) геликазы ("расплетают" ДНК); 2) дестабилизирующие белки; 3) ДНК-топоизомеразы (разрезают ДНК); 4) ДНК-полимеразы (подбирают дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и комплементарно присоединяют их к матричной цепи ДНК); 5) РНК-праймазы (образуют РНК-затравки, праймеры); 6) ДНК-лигазы (сшивают фрагменты ДНК). С помощью геликаз в определенных участках ДНК расплетается, одноцепочечные участки ДНК связываются дестабилизирующими белками, образуется репликационная вилка. При расхождении 10 пар нуклеотидов (один виток спирали) молекула ДНК должна совершить полный оборот вокруг своей оси. Чтобы предотвратить это вращение ДНК-топоизомераза разрезает одну цепь ДНК, это дает возможность вращаться ей вокруг второй цепи. ДНК-полимераза может присоединять нуклеотид только к 3'-углероду дезоксирибозы предыдущего нуклеотида, поэтому данный фермент способен передвигаться по матричной ДНК только в одном направлении: от 3'-конца к 5'-концу этой матричной ДНК. Так как в материнской ДНК цепи антипараллельны, то на ее разных цепях сборка дочерних полинуклеотидных цепей происходит по-разному и в противоположных направлениях. На цепи "3'-5'" синтез дочерней полинуклеотидной цепи идет без перерывов, эта дочерняя цепь будет называться лидирующей. На цепи "5'-3'" – прерывисто, фрагментами (фрагменты Оказаки), которые после завершения репликации ДНК-лигазами сшиваются в одну цепь; эта дочерняя цепь будет называться запаздывающей (отстающей). Особенность ДНК-полимеразы – она может начинать свою работу только с "затравки" (праймера). Роль затравок выполняют короткие последовательности РНК, образуемые при участи фермента РНК-праймазы и спаренные с матричной ДНК. РНК-затравки после окончания сборки полинуклеотидных цепочек удаляются и заменяются на нуклеотиды ДНК другой ДНК-полимеразой.

Репликация протекает сходно у прокариот и эукариот. Скорость синтеза ДНК у прокариот на порядок выше (1000 нуклеотидов в секунду), чем у эукариот (100 нуклеотидов в секунду). Репликация начинается одновременно в нескольких участках молекулы ДНК, имеющих определенную нуклеотидную последовательность и называемых ориджинами (англ. origin – начало). Фрагмент ДНК от одной точки начала репликации до другой образует единицу репликации – репликон.

Репликация происходит перед делением клетки. Благодаря этой способности ДНК, осуществляется передача наследственной информации от материнской клетки дочерним.

Репарация ("ремонт") – процесс устранения повреждений нуклеотидной последовательности ДНК. Осуществляется особыми ферментными системами клетки (ферменты репарации). В процессе восстановления структуры ДНК можно выделить следующие этапы: 1) ДНК-репарирующие нуклеазы распознают и удаляют поврежденный участок, в результате чего в цепи ДНК образуется брешь; 2) ДНК-полимераза заполняет эту брешь, копируя информацию со второй ("хорошей") цепи; 3) ДНК-лигаза "сшивает" нуклеотиды, завершая репарацию.

Главные отличительные особенности генетического материала состоят в том, что он служит носителем информации и способен к самовоспроизведению. Модель Уотсона - Крика объясняет, каким образом молекула ДНК может выполнять обе эти функции. При репликации (самоудвоении) молекулы ДНК две ее цепи отделяются друг от друга и около каждой из них образуется новая цепь, комплементарная старой. Так возникают две новые цепи (рис. 96). При построении новой цепи нуклеотиды располагаются в ней совершенно определенным образом, так как пурины и пиримидины исходной цепи образуют водородные связи с комплементарными им пиримидинами или пуринами нуклеотидов, находящихся в форме трифосфатов в окружающей среде, и тем самым выстраивают их в комплементарной старой цепи последовательности. Между соседними нуклеотидами в результате реакции, катализируемой ДНК-полимеразой, образуются фосфорноэфирные связи и таким образом возникает новая полинуклеотидная цепь. Затем эта новая и исходная цепи закручиваются одна вокруг другой, образуя новую молекулу ДНК. Короче говоря, каждая из цепей исходной молекулы служит матрицей, или "шаблоном", для синтеза новой цепи, которая и становится ее партнером. В итоге получаются две полные двухцепочечные молекулы, идентичные исходной молекуле.

Вторая важнейшая функция ДНК состоит в том, что ее молекула, помимо собственной репликации, должна еще в определенное время между клеточными делениями обеспечить транскрипцию той информации, которая заключена в специфической последовательности ее нуклеотидов. Затем продукт этого процесса транскрипции - информационная РНК - соединяется с рибосомами для осуществления синтеза определенного фермента или иного специфического белка.

Синтез (репликация ДНК)

В первые же годы после того, как Уотсон и Крик предложили свою модель, появились новые подтверждающие ее экспериментальные данные. В 1957 году А. Корнберг и его сотрудники выделили из бактерий фермент ДНК-полимеразу, катализирующий синтез ДНК из трифосфатов всех четырех дезоксирибонуклеозидов (сокращенно дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ). Для этого синтеза нужны также ионы магния (Mg²⁺) и небольшие количества высокомолекулярной ДНК, которая служит "затравкой", или матрицей. В результате реакции образуется новая ДНК, идентичная ДНК-матрице, и одна молекула пирофосфата на каждую включенную молекулу дезоксирибонуклеотида:

дАТФ |
     |             ДНК
дГТФ |             Mg++
     | ------------------------------->    ДНК + nФФн 
дЦТФ |        ДНК-полимераза
     |      
дТТФ |

Нуклеозидтрифосфат реагирует со свободным 3'-гидроксилом последней дезоксирибозы в цепи и образует эфирную связь, освобождая молекулу пирофосфата (рис. 97). Если в опыте использовали трифосфаты нуклеотидов, меченных ¹⁴С, то образующийся полимер ДНК содержал ¹⁴С, и из этого можно было заключить, что меченые нуклеотиды вошли в состав новых цепей ДНК. Путем соответствующих экспериментов с ¹⁴С-нуклеотидами Корнбергу удалось показать, что отношения А : Т и Г : Ц в синтезированной ДНК были такими же, как и в ДНК, взятой в качестве затравки. Это позволяло предполагать, что новая ДНК была копией ДНК-"затравки", как и следовало ожидать, исходя из модели Уотсона - Крика.

В экспериментах с ДНК-полимеразой из кишечной палочки (Escherichia coli) можно использовать в качестве матрицы ДНК, полученную из самых разнообразных источников - бактерий, вирусов, млекопитающих и растений; при этом синтезируется ДНК, сходная по соотношению нуклеотидов с ДНК-матрицей. Таким образом, последовательность нуклеотидов в продукте реакции определяется их последовательностью в затравке, а не свойствами полимеразы и не соотношениями между молекулами субстратов, находящихся в реакционной смеси. В 1968 году Корнберг, использовав более чистый препарат фермента и взяв в качестве затравки ДНК бактериофага, синтезировал биологически активную вирусную (фаговую) ДНК, которая могла инфицировать бактерии совершенно так же, как "живые" фаги.

Корана и его сотрудники приготовили синтетические полидезоксирибонуклеотиды, содержавшие адениловую и цитидиловую кислоты, и другие полинуклеотиды, в которых чередовались тимидиловая и гуаниловая кислоты. Оказалось, что ни те, ни другие по отдельности не могут служить матрицами для синтеза ДНК-полимеразы, но их смесь, в которой образуется синтетическая двойная спираль с обычным попарным соединением оснований, действует как матрица.

По-видимому, в ДНК-полимеразной системе ДНК-затравка выполняет две функции: во-первых, она содержит свободные 3'-ОН-группы, способные служить "точками роста" полимера, и, во-вторых, доставляет кодированную информацию. Для выполнения этих функций молекула должна быть двухцепочечной, так как каждая из двух цепей должна служить матрицей для наращивания комплементарной цепи. Одновременно она служит затравкой для своего собственного удлинения. ДНК-подобный полимер, синтезируемый под действием ДНК-полимеразы в присутствии двухцепочечной затравки, также состоит из двух цепей и имеет такой же состав оснований, как и затравочная ДНК. Соотношения оснований согласуются с моделью Уотсона - Крика.

В клетках высших организмов синтез ДНК происходит только во время интерфазы, когда хромосомы трудно увидеть. Таким образом, если синтез ДНК in vivo также катализируется ферментом, сходным с ДНК-полимеразой Корнберга, то должен существовать какой-то биологический сигнал, "включающий" синтез ДНК в период интерфазы и "выключающий" его в другое время. По-видимому, как сам фермент, так и его субстраты - дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ - имеются в клетках всегда, так что "включение" и "выключение" синтеза ДНК, вероятно, определяется каким-то изменением в ДНК-матрице.

В результате репликации ДНК образуются две новые цепи, каждая из которых комплементарна к одной из старых цепей двойной спирали ДНК. Эта двойная спираль в процессе репликации раскручивается; одна из ее цепей служит матрицей для синтеза одной новой цепи, а другая - для синтеза другой новой цепи. Такая репликация называется полуконсервативной: обе первоначальные цепи ДНК сохраняются в дочерних двойных спиралях, по одной в каждой из них.

Классический эксперимент Месельсона и Сталя (рис. 98), использовавших для различения "старых" и "новых" молекул ДНК тяжелый азот ¹⁵N, показал, что репликация ДНК, по крайней мере у бактерий, относится к полу-консервативному типу. В этом эксперименте бактерий выращивали на протяжении ряда генераций на среде, содержавшей тяжелый азот, и поэтому их ДНК (так же как РНК и белок) содержала ¹⁵N. Когда выделили некоторое количество ДНК и подвергли ее центрифугированию в градиенте плотности хлористого цезия, ДНК собралась в определенном слое - на уровне, который определялся наличием в ее молекулах тяжелого азота.

Затем бактерий перенесли из среды с ¹⁵N на среду, содержавшую обычный азот ¹⁴N, и оставили в ней на время, достаточное для одного деления клеток. Когда выделенную из нового поколения ДНК подвергли центрифугированию, то оказалось, что вся эта ДНК легче родительской: плотность ее была такой, как если бы в ней было вдвое меньше ¹⁵N, чем в родительской ДНК. Если теория Уотсона - Крика верна и репликация происходит полу-консервативным способом, то следовало ожидать именно такого результата, так как в этом случае одна цепь двойной спирали ДНК должна содержать ¹⁵N, а другая - только ¹⁴N.

Когда этим бактериям дали возможность пройти еще один цикл деления на среде с ¹⁴N, каждая из дочерних молекул ДНК снова получила одну родительскую цепь и одну новую цепь, содержащую только ¹⁴N. В результате образовалось некоторое число двухцепочных молекул ДНК, содержавших только ¹⁴N, и при центрифугировании эти молекулы образовали полосу с меньшей плотностью. Около тех родительских цепей, которые содержали ¹⁵N, построились комплементарные цепи с ¹⁴N; плотность этих дочерних двойных спиралей соответствовала плотности, характерной для молекул, содержащих в равных количествах ¹⁵N и ¹⁴N. Таким образом, в процессе репликации цепи родительской ДНК не расщепляются на составные части или хотя бы на крупные фрагменты, а сохраняются в целости и передаются следующему поколению. Каждая из дочерних клеток получает одну из цепей родительской двойной спирали и одну вновь синтезированную цепь; поэтому такой процесс и называют "полуконсервативным".

Если репликация цепей начинается уже в период их раскручивания, то в это время должны появляться молекулы ДНК Y-образной конфигурации. Такие Y-образные участки действительно были обнаружены при радиоавтографии хромосом кишечной палочки, меченных ³Н-тимидином (рис. 99 и 100).

Нуклеиновые кислоты и систематика организмов

Нуклеиновые кислоты являются материальным носителем наследственной информации и определяют видоспецифичность организма, сложившуюся в ходе эволюции. Изучение особенностей нуклеотидного состава ДНК разных организмов позволило перейти от систематики по внешним признакам к систематике генетической. Это направление в молекулярной биологии получило название геносистематики. Основателем его был выдающийся советский биохимик А. Н. Белозерский.

Сравнение нуклеотидного состава ДНК разных организмов привело к интересным выводам. Оказалось, что коэффициент специфичности ДНК, т. е. отношение Г + Ц к А + Т, сильно варьирует у микроорганизмов и довольно постоянен у высших растений и животных. У микроорганизмов наблюдаются колебания изменчивости от крайнего ГЦ-типа до выраженного АТ-типа. ДНК высших организмов стойко сохраняет АТ-тип. Может создаться впечатление, что у высших организмов теряется специфичность ДНК. На самом деле у них она так же специфична, как и у бактерий, но ее специфичность определяется не столько изменчивостью состава нуклеотидов, сколько последовательностью чередования их вдоль цепи. Интересные выводы на основании нуклеотидного состава ДНК были сделаны А. Н. Белозерским и его учениками относительно происхождения многоклеточных животных и высших растений. Их ДНК АТ-типа ближе всего к ДНК грибов, поэтому свою родословную животные и грибы, очевидно, ведут от общего предка - крайне примитивных грибообразных организмов.

Еще большую информацию о родстве организмов дает метод молекулярной гибридизации. С помощью этого метода была установлена высокая гомологичность ДНК человека и обезьяны. Причем по составу ДНК человека всего на 2-3% отличается от ДНК шимпанзе, чуть больше - от ДНК гориллы, более чем на 10% - от ДНК остальных обезьян, а от ДНК бактерии - почти на 100%. Особенности первичной структуры ДНК тоже можно использовать в систематике. Гомология по участкам повторяющихся последовательностей (быстрая гибридизация) используется для макросистематики, а для уникальных фрагментов ДНК (медленная гибридизация) - для микросистематики (на уровне видов и родов). Ученые считают, что постепенно по ДНК можно будет построить все родословное древо живого мира.