СОДЕРЖАНИЕ Введение Первобытная биотехнология - основа цивилизации Успехи "домолекулярной" биотехнологии Микроорганизмы - продуценты веществ и энергии Некоторые сведения из молекулярной биологии Принципы и методы генетической инженерии Инженерия клеток Биотехнология синтеза белков человека Перенос генов в клетки животных и растений Заключение Литература [показать] Основные направления экономического и социального развития СССР на 1986-1990 годы и на период до 2000 года. - М.: Политиздат, 1986. Биология развития и управление наследственностью / Отв. редактор член-корреспондент АН СССР В. А. Струнников. - М.: Наука, 1986. Биотехнология / Под ред. академика А. А. Баева. - М.; Наука, 1984. Биотехнология. Подписной теоретический и научно-практический журнал Министерства медицинской и микробиологической промышленности СССР. Выходит с 1985 г. Беккер М. Е. Введение в биотехнологию. - М.: Пищевая промышленность, 1978. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Проблема сохранения генофонда. - М.: Знание (серия "Биология"), 1985. Березин Й. В., Яцимирский А. К. Биотехнология и ее перспективы, - М.: Знание (серия "Биология"), 1986. ДубиниЙ Н. П. Очерки о генетике. - М.: Советская Россия, 1985. Достижения биологии - Продовольственной программе, - М.: Знание (серий "Биология"), 1984. Пехов А. П. Биология и научно-технический прогресс. - М.: Знание (серия "Биология"), 1984, Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии. - М.: Мир, 1984. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. - М.: Мир, 1983.

В брошюре рассказывается о научных предпосылках биотехнологии - успехах в изучении биологии клетки, строения и функций генетического аппарата и о путях использования этих теоретических знаний в решении практических задач, важных для сельского хозяйства, биологической промышленности и медицины. Рассматриваются основные направления современной биотехнологии, ее близкие и далекие перспективы. НЕЙФАХ Александр Александрович - доктор биологических наук, главный научный сотрудник Института биологии развития АН СССР. Автор открытия периодичности морфогенетической функции ядер (1962 г.) и более 150 научных работ и 5 книг по вопросам молекулярной биологии развития, изданных у нас и за рубежом. Рецензент Н.Г. Xрущов, член-корреспондент АН СССР.

Биотехнология синтеза белков человека

Методы генетической инженерии позволили осуществить синтез некоторых белков в промышленных количествах. Пока это оказалось возможным и экономически оправданным лишь для нескольких белков человека, которые используются в медицинских целях и являются видоспецифичными, т.е. не могут быть заменены аналогичными белками животных. Речь идет прежде всего об инсулине, интерфероне и гормоне роста - соматотропине. Список этот сейчас расширяется, и в нем появляются не только белки человека.

В 1985 г. в мире насчитывалось более 80 млн. больных диабетом и около 5 млн. из них нуждаются в постоянных инъекциях инсулина. Приблизительно 1/20 из этих больных, т. е. около 250 тыс. человек, не переносят инсулина животных - он вызывает у них необратимые поражения почек и глаз, поэтому им может помочь только инсулин человека. Готовый инсулин - небольшой белок, состоящий из двух цепей: одна из них содержит 21, а другая - 30 аминокислот. Но синтезируется инсулин в виде более длинной молекулы, состоящей из 109 аминокислот. В особых клетках поджелудочной железы, где происходят синтез и секреция инсулина, от этой длинной цепи сначала отщепляются 23 аминокислоты, а затем еще 35, так что остаются две цепочки, связанные друг с другом двумя дисульфидными мостиками. Инсулин человека отличается от инсулина животных по нескольким аминокислотам - наиболее близким оказался инсулин свиньи, отличающийся заменой всего одной аминокислоты.

Небольшую молекулу инсулина можно синтезировать искусственно, присоединяя одну аминокислоту за другой. Но стоит это слишком дорого. Оказалось проще получить инсулин человека, если модифицировать инсулин свиньи, т. е. химически заменять в нем тридцатую аминокислоту - аланин на треонин. Эта процедура сейчас освоена в Дании, и такой инсулин успешно конкурирует с инсулином человека, получаемым генно-инженерным способом в клетках кишечной палочки.

Было испытано несколько путей генетической инженерии для получения инсулина. Клонировать целый ген человеческого инсулина, кодирующий большую цепочку из 109 аминокислот, оказалось явно не целесообразно - в клетках бактерий нет ферментов, способных правильно отрезать лишние части молекулы и превращать ее в готовый инсулин. В одних странах пошли по пути синтеза ДНК на мРНК инсулина, т. е. получения кДНК (США), а в других - химического синтеза двух коротких цепочек ДНК, кодирующих обе цепи готового инсулина (Канада и СССР). Однако оказалось, что, если короткие цепочки чужеродного белка синтезируются в бактерии, они тут же разрушаются ее протеолитическими ферментами. Тогда ДНК, кодирующие каждую из цепочек инсулина, пришили с помощью лигазы к гену бактериального фермента галактозидазы, разделив их кодоном, кодирующим метионин. В результате в бактериях синтезировался большой белок, состоящий из бактериального фермента и гормона. Друг от друга их разделяли химически, разрезая белок по метионину.

Были и другие подходы, позволяющие получить готовый и полноценный инсулин человека практически в любых количествах. Сейчас из 1 л суспензии бактерий удается получить более 200 мг инсулина - количество, которое извлекают почти из 2 кг поджелудочных желез, полученных от 8-10 коров. Этого достаточно, чтобы обеспечить среднюю потребность в инсулине одного больного диабетом в течение 100 дней. В 1982 г. он появился в продаже как первый белок, необходимый для медицинских целей и синтезированный с помощью методов генетической инженерии. По мере роста производства стоимость его будет уменьшаться, но и сейчас человеческий инсулин стоит не дороже полученного из поджелудочных желез животных.

Более сложным было выделение и клонирование генов другого белка - человеческого интерферона. Этот белок синтезируется в некоторых клетках животных и человека в ответ на вирусную инфекцию и каким-то пока не вполне ясным образом способствует защите организма от этой инфекции. Поэтому лечение интерфероном применяют сейчас при многих вирусных болезнях. Есть также данные о том, что интерферон помогает при некоторых видах злокачественных заболевании, правда, при этом нужны очень высокие его дозы.

Человеку помогает только интерферон человека, поэтому его начали получать из клеток крови человека (альфа-интерферон лейкоцитов) и из культуры фибробластов (бета-интерферон). В Т-лимфоцитах есть еще гамма-ннтерферон. Эффективность производства интерферона путем простого выделения очень низка, и стоит он поэтому очень дорого. Из 250 л крови (ее можно получить от 500-1000 доноров) можно получить 0,5 мг чистого альфа-интерферона, что достаточно для лечения 50 легких больных или одного тяжелого. Из культуры фибробластов выход бета-интерферона больше, но тем не менее, по американским данным, лечение одного ракового больного большими дозами интерферона обходится в 20-40 тыс. долл. Поэтому понятно, что для получения интерферона генно-инженерным путем были приложены большие усилия.

Трудности возникли прежде всего при выделении гена интерферона. Эти работы в 1980-1982 гг. были проведены в нескольких лабораториях за рубежом и в нашей стране. Дело в том, что оказалось практически невозможно получить мРНК интерферона, так как ее содержание в лейкоцитах не превышает 0,1%. Поэтому сначала на суммарном препарате мРНК лейкоцитов с помощью обратной транскриптазы синтезировали сумму всех кДНК (кДНК интерферона, очевидно, составляла среди них 0,1%). Тем не менее отбор из "библиотеки" генов человека путем гибридизации с этой суммарной кДНК позволил исключить 90% всех фрагментов ДНК. После этого оставалось около 5000 клонов, среди которых должны быть и клоны с генами интерферона. Затем ДНК из каждого клона гибридизировали с суммарной РНК лейкоцитов, что позволяло выделять какой-то один вид мРНК. Каждую выделенную таким образом мРНК проверяли - не является ли она интерфероновой. Для этого ее инъецировали в незрелые яйца (ооциты) лягушек, где на ней происходил синтез того белка, который эта мРНК кодировала. Появление интерферона в таких ооцитах обнаруживали по их противовирусной активности в культуре тканей. Таким путем удалось обнаружить интерфероновую мРНК, а следовательно, и тот клон бактерий из "библиотеки" генов, в котором оказалась плазмида с геном интерферона человека.

Однако трудности на этом не кончились. Полученные гены содержали и те части ДНК, которые кодировали "сигнальную последовательность" белка, не входящую в молекулу зрелого готового интерферона. Их удаление осуществили с помощью одной из рестриктаз, которая, однако, вместе с "лишней" ДНК удалила и три нуклеотида, кодирующих первую аминокислоту готового интерферона. Пришлось синтезировать небольшой фрагмент ДНК, содержащий этот кодон, а также находящийся впереди него инициирующий кодон, без которого не мог бы начаться синтез белка. Полученный таким путем реконструированный ген интерферона поместили обычным путем в плазмиду, совместив его с бактериальным промотором. В итоге этой работы в СССР, например, был получен очень продуктивный штамм кишечной палочки: 1 л суспензии эти бактерии давал более 10 мг альфа-интерферона, т.е. в 5000 раз больше, чем получали из 1 л крови доноров.

Непростым оказалось и выделение интерферона, который накапливался в бактериальной клетке. Кишечная палочка "не умеет" секретировать белки, и нужный белок приходится выделять и очищать от всей массы белка бактерий. Для очистки использовали моноклональные антитела к интерферону, т.е. иммуноглобулин, который связывался только с альфа-интерфероном. Эти антитела пришивали к полисахаридным шарикам, через которые пропускали смесь белков - интерферон захватывался антителами и удерживался на шариках. Потом его смывали и получали готовый препарат, в 5000 раз лучше очищенный, чем исходный.

Подобным путем сейчас продуцируются и другие классы интерферонов - бета и гамма, а также гибридный интерферон, составленный из половинок молекуя разных интерферонов, что позволяет сравнивать действие разных препаратов. Однако интереферон, синтезированный в бактериях, не содержит необходимых в норме углеводных групп, присоединенных к белку, т. е. не гликозилирован. Это следствие того, что в клетках прокариот нет соответствующих ферментов гликозилирования. Тогда, используя подходящий вектор, ген интерферона ввели в дрожжевые клетки, которые синтезировали интерферон в 10 раз интенсивнее бактерий (в расчете на 1 л суспензии) и в гликозилированном виде. Впрочем, роль гликозилирования пока не ясна, так как и интерферон из бактерий обладает такой же активностью.

В СССР и в Англии трудности выделения гена интерферона были преодолены иным путем. Ген интерферона синтезировали химически, присоединяя один нукдеотид за другим. Каждый раз это был цикл химических реакций, занимающий 1,5 ч. Большую молекулу такого искусственного гена, состоящую из 514 нуклеотидов, собирали из 8 отдельно синтезированных фрагментов. Эта работа заняла приблизительно столько же времени, сколько и сложное выделение гена интерферона.

Благодаря генетической инженерии стоимость интерферона упала почти в 100 раз. Однако до сих пор не ясно, какая группа интерферонов эффективнее и при каких заболеваниях. Получение дешевого препарата позволит значительно увеличить его дозу при лечении опухолей, что до сих пор было невозможно.

Третий белок, получаемый генно-инженерным способом и тоже поступивший в продажу, это соматотропин, гормон роста. Соматотропин синтезируется в передней доле гипофиза и в готовом виде содержит 191 аминокислоту. Однако синтезируется он большего размера, вместе с "сигнальной последовательностью", которая удаляется в процессе секреции гормона из клетки. Этот гормон стимулирует рост детей. При наследственном отсутствии активного гормона ребенок остается карликом. Среди европейцев и белых североамериканцев этот тяжелый генетический дефект встречается у одного из 5000 детей (у других народов - реже). Наследственную карликовость можно преодолеть, если ребенку в течение 4-5 лет трижды в неделю вводить по 2 мг гормона. Однако соматотропин видоспецифичен, следовательно, он должен быть выделен только из гипофизов, полученных из трупов людей. Например, в США извлекают до 60 тыс. гипофизов в год, их хватает на лечение 1500 детей, в то время как потребности в гормоне значительно больше (даже в развитых странах до сих пор лечили только 1/3 нуждающихся в этом детей).

В США ген соматотропина получали через мРНК, синтеза на ней кДНК и клонирования. Однако полученный ген был лишен первых 72 нуклеотидов. Их пришлось синтезировать химическим путем, присоединить к ним инициирующий кодон и сшить с клонированным геном. В нашей стране этот же ген был получен целиком (без "сигнальной последовательности"). Ген был включен в плазмиду после бактериального промотора и перенесен в клетки кишечной палочки. Таким путем удалось получить очень интенсивный синтез соматотропина, который достигал 1% синтеза всех белков бактерии. 1 л суспензии таких бактерий производил за 7 ч столько гормона, сколько содержится в 60 гипофизах человека.

Очистку гормона от бактериальных белков, так же как и интерферона, осуществляют с помощью моноклональных антител. Производство соматотропина начато в Швеции в 1982 г., и цена его постепенно снижается. Пока генно-инженерный соматотропин используют только для лечения детей. Он так же активен, как природный гормон, и вызывает увеличение роста детей с наследственной карликовостью на 8-18 см в год. Предполагается, что аналогичный гормон коров (когда он станет дешевле) будут применять в животноводстве для стимуляции роста молодняка и продукции молока.

Много усилий было затрачено на то, чтобы с помощью генетической инженерии производить дешевые н безопасные вакцины против болезней человека и животных, особенно вызываемых вирусами. При вакцинации против вируса в организм вводят неактивный вирус, вызывают против него образование антител и тем самым делают организм устойчивым к попаданию в него активного вируса. Однако выделение достаточных количеств вирусных частиц - сложная процедура, а инактивация вирусных нуклеиновых кислот (например, ультрафиолетом или химическими агентами) не всегда надежна, так как сохранение активности даже у миллионной части вирусов может вызвать заражение при вакцинации (что иногда и происходит). Поэтому было заманчиво попытаться клонировать гены, кодирующие вирусные белки, ввести их в бактерию или другие клетки и таким путем производить большое количество вирусного белка, заведомо лишенного нуклеиновых кислот, т. о. совершенно безопасного.

Гепатит В, вызываемый вирусом, - опасная болезнь, плохо поддается лечению и передается от матери к детям. Антигенные свойства этого вируса определяются двумя одинаковыми белками один из которых, однако, гликозилирован (к нему присоединены углеводные цепочки). Кроме того, эти белки содержат вариабельную область - последовательности аминокислот между, 114-й н 143-й часто отличаются у разных штаммов вируса, и поэтому создаются различия в их антигенных свойствах. Это защищает вирус, от иммунной системы человека, так как иммунитет к одному варианту вируса может не защищать от другого его варианта.

Вирусную ДНК гепатита В клонировали в кишечной палочке, в которой синтезировался вирусный белок, однако вызывавший слабую вакцинацию. Более успешными были эксперименты, в которых плазмиду вводили в клетки дрожжей, где может происходить нормальное гликозилирование. Для производства вирусного белка использовали также культуру клеток мышей или обезьян. В клетки вводили вирусную ДНК, которая включалась в хромосомную ДНК клетки, и далее эти клетки синтезировали вирусный белок, обладавший высокой вирусной антигенностью. Практический результат в конце концов был достигнут с дрожжами. Сейчас в США вакцина, полученная таким путем, поступила в продажу.

Иной путь для создания вакцины против гепатита В был избран в нашей стране: ДНК, кодирующая вирусный белок гепатита, была пришита к ДНК вируса оспы. Теперь ослабленная культура оспы, которую издавна используют для прививок против этого практически исчезнувшего заболевания, одновременно вызывает и иммунитет против гепатита В. Сейчас вакцина проходит производственные испытания. На очереди дальнейшее развитие этого приема - к оспенной ДНК можно пришить ДНК многих вирусов и таким путем создать поливакцину, защищающую сразу от нескольких болезней.

Генно-инженерным способом получена также вакцина против ящура. Ящур - тяжелое эпидемическое заболевание домашнего скота, опасное и для человека. Для вакцинации вирус ящура выращивают на культуре тканей, но полученная таким путем вакцина только сдерживает распространение этой болезни. Вакцина плохо хранится, а иногда оказывается болезнетворной. Все это побудило попытаться наладить синтез вирусных белков с помощью рекомбинантной ДНК. Вирус ящура состоит из одной цепочки РНК и оболочки, включающей 60 молекул белка четырех видов. Три из них не проявляют иммуногенности и лишь один - ВП₁ - обладает слабыми антигенными свойствами. Таким путем паразит (вирус) защищается от действия иммунной системы хозяина.

На вирусной РНК ящура была синтезирована двуцепочная ДНК, и из нее был клонирован ген, кодирующий ВП₁. В кишечной палочке этот белок в первых экспериментах синтезировался слабо (1000 молекул на клетку), но когда система промоторов была улучшена, синтез достиг 10⁶ мол/клетку. Однако оказалось, что полученный таким образом вирусный белок обладает в тысячу раз меньшей антигенной активностью, чем целая вирусная частица. Это связано с тем, что в составе частицы белок ВП₁ имеет несколько иную структуру, нежели свободная молекула. Тем не менее вакцина против ящура, полученная генно-инженерным путем, поступила в продажу. Она безопасна и для хранения не требует замораживания.

Следует признать, что пока вакцины, полученные с помощью рекомбинантной ДНК, не получили большого распространения. Вероятно, их станет больше, когда в качестве клеток-продуцентов будут шире использовать дрожжи или клетки млекопитающих в культуре. В литературе можно встретить много высказываний о создании синтетической вакцины, содержащей антигенные детерминанты к нескольким или даже ко многим заболеваниям. Серьезным препятствием к созданию таких вакцин и противовирусных вакцин вообще является большая изменчивость именно антигенных свойств вирусных белков. Примером такой изменчивости может служить вирус гриппа, к которому не возникает долговременного иммунитета.

Источник: Нейфах А.А. Клеточные и генетические основы биотехнологии. - М.: Знание (серия "Биология"), 1987.