СОДЕРЖАНИЕ Введение Первобытная биотехнология - основа цивилизации Успехи "домолекулярной" биотехнологии Микроорганизмы - продуценты веществ и энергии Некоторые сведения из молекулярной биологии Принципы и методы генетической инженерии Инженерия клеток Биотехнология синтеза белков человека Перенос генов в клетки животных и растений Заключение Литература [показать] Основные направления экономического и социального развития СССР на 1986-1990 годы и на период до 2000 года. - М.: Политиздат, 1986. Биология развития и управление наследственностью / Отв. редактор член-корреспондент АН СССР В. А. Струнников. - М.: Наука, 1986. Биотехнология / Под ред. академика А. А. Баева. - М.; Наука, 1984. Биотехнология. Подписной теоретический и научно-практический журнал Министерства медицинской и микробиологической промышленности СССР. Выходит с 1985 г. Беккер М. Е. Введение в биотехнологию. - М.: Пищевая промышленность, 1978. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Проблема сохранения генофонда. - М.: Знание (серия "Биология"), 1985. Березин Й. В., Яцимирский А. К. Биотехнология и ее перспективы, - М.: Знание (серия "Биология"), 1986. ДубиниЙ Н. П. Очерки о генетике. - М.: Советская Россия, 1985. Достижения биологии - Продовольственной программе, - М.: Знание (серий "Биология"), 1984. Пехов А. П. Биология и научно-технический прогресс. - М.: Знание (серия "Биология"), 1984, Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии. - М.: Мир, 1984. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. - М.: Мир, 1983.

В брошюре рассказывается о научных предпосылках биотехнологии - успехах в изучении биологии клетки, строения и функций генетического аппарата и о путях использования этих теоретических знаний в решении практических задач, важных для сельского хозяйства, биологической промышленности и медицины. Рассматриваются основные направления современной биотехнологии, ее близкие и далекие перспективы. НЕЙФАХ Александр Александрович - доктор биологических наук, главный научный сотрудник Института биологии развития АН СССР. Автор открытия периодичности морфогенетической функции ядер (1962 г.) и более 150 научных работ и 5 книг по вопросам молекулярной биологии развития, изданных у нас и за рубежом. Рецензент Н.Г. Xрущов, член-корреспондент АН СССР.

Микроорганизмы-продуценты веществ и энергии

Микроорганизмы в виде заквасок для приготовления пива и вина сознательно использовали еще в Вавилоне (4 тыс. лет назад) и у шумеров (более 5 тыс. лет назад). Сейчас люди используют уже сотни видов микроорганизмов, и число это растет. Но качественный скачок в их использовании произошел, вероятно, 20-30 лет назад, когда были поняты многие генетические механизмы регуляции биохимических процессов, происходящих у микроорганизмов, а сама их генетика стала такой же строгой наукой, как до того генетика высших эукариот. Все эти годы происходило не только увеличение наших знаний о микроорганизмах, но и совершенствование технологии их использования в практических целях. Все это послужило базой для создания микробиологической промышленности - важной и самостоятельной отрасли современного производства.

Научная основа этой промышленности - умение создавать микроорганизмы с новыми, заранее заданными генетическими свойствами и умение использовать их в промышленных масштабах. В последние годы к этим методам подключились возможности генетической инженерии. Однако в этом разделе мы почти не будем о ней упоминать - ее практический вклад пока невелик, - а расскажем о двух главных направлениях в использовании микроорганизмов - получении веществ и энергии. Это второе направление занимает пока скромное место, но его ждет большое будущее.

Среди множества веществ, синтезируемых с помощью микроорганизмов, на первом месте должно, очевидно, стоять получение некоторых аминокислот, в первую очередь лизина. Если бы мы систематически вводили в рацион сельскохозяйственных животных эти аминокислоты дополнительно, а также некоторые витамины, мы могли бы, расходуя вдвое меньше растительных кормов, получать такое же количество животных белков. Конечно, это экономически оправданно, если такой сбалансированный рацион достаточно дешев. Поэтому-то большие усилия микробиологов были направлены на то, чтобы создать микроорганизмы, которые производят и выделяют необходимые нам вещества в количествах, в десятки, сотни и тысячи раз превосходящих потребности самих микроорганизмов. Таких производителей называют "сверхпродуценты".

Микробиологическое производство лизина в 1980 г. достигло почти 50 тыс. т, хотя потребности в лизине в мире значительно больше. В СССР было произведено 9 тыс. т, а в 1985 г. уже 18 тыс. т, и число это продолжает расти. Это удалось благодаря созданию чрезвычайно эффективных штаммов, у которых почти 1/3 источников углерода (сахаров или уксусной кислоты) превращается в лизин.

Среди бактерий, продуцентов лизина, были найдены мутанты, у которых был блокирован синтез метионина и треонина - аминокислот, синтез которых конкурирует с лизином за источник углерода. Кроме того, у них был найден мутант с измененной структурой важного фермента - аспартаткиназы.

У нормальных бактерий избыток лизина действует именно на этот фермент, уменьшает его активность и таким путем тормозит синтез новых порций лизина. Иными словами, через аспартаткиназу осуществлялась обратная связь, регулирующая количество лизина (больше лизина - медленнее его синтез, меньше лизина - быстрее его синтез). При наследственном изменении структуры аспартаткиназы она по-прежнему участвовала в синтезе лизина, но не реагировала на него - обратная связь прервалась, и лизин мог неограниченно накапливаться. Это, конечно, было невыгодно бактерии, но выгодно человеку.

Мы так подробно остановились на этих работах с лизином потому, что этот принцип - нарушение обратной связи - используется почти во всех других работах по выведению сверхпродуцентов самых различных веществ.

Большая работа была проведена в нашей стране по получению штамма кишечной палочки - сверхпродуцента другой аминокислоты - треонина. Прежде всего и здесь были получены мутанты с нарушенной обратной связью, регулирующей синтез треонина. Отбор таких мутантов производится довольно изящным образом: в среду добавляют аналог - химически модифицированный треонин, который подавляет синтез настоящего треонина. Нормальные клетки на такой среде из-за отсутствия в них треонина расти не могут. В то же время мутанты, у которых обратная связь нарушена, в присутствии аналога хорошо растут, ведь у них настоящий треонин синтезируется нормально. Это позволяет выбрать такие мутантные клетки среди многих тысяч не-мутантов. Далее, на следующем этапе работы, количество генов синтеза треонина было увеличено за счет введения в клетки кишечной палочки большого количества плазмид (кольцеобразных ДНК, см. ниже), несущих эти гены. И наконец, на последнем этапе в эти клетки ввели гены, определяющие способность бактерии в качестве источника углерода использовать дешевую сахарозу вместо дорогой глюкозы. Все это привело к созданию бактерий-сверхпродуцентов, дающих за 40 ч до 80-100 г треонина на 1 л суспензии, т. е. 8-10%-ный раствор треонина.

Можно было бы получить штаммы микроорганизмов, так же интенсивно синтезирующих и третью необходимую животным аминокислоту - метионин. Но оказалось, что эту аминокислоту пока выгоднее синтезировать химическим путем. Вообще в зависимости от мировых цен на сырье (например, нефть) и от других причин стратегия может меняться: то, что сегодня выгоднее получать химически, завтра станет дешевле получать на промышленных микробиологических установках. Например, хотя количество лизина, производимого во всем мире, быстро растет, его производство не очень развито в США и даже в Западной Европе. Дело в том, что в США традиционно и благодаря подходящим климатическим условиям выращивают много сои - растения, содержащего белки, богатые лизином (6%). Добавление соевых бобов в корма во многом решает у них проблему лизина и других аминокислот.

В нашей же стране, где для широкого разведения сои мало тепла, лизин выгоднее получать с помощью микроорганизмов, растущих на дешевом сырье. И хотя производство лизина у нас быстро растет, потребности в нем, однако, полностью еще не удовлетворены. Ведь добавление в корма одной тонны лизина эквивалентно экономии многих десятков тонн растительных кормов. Во всем же мире с 1980 по 1990 г. производство аминокислот должно возрасти более чем в 1,5 раза.

Другая группа химических соединений, необходимых животным и человеку, - витамины: низкомолекулярные органические соединения, необходимые для нормальной жизнедеятельности организма, которые он не может синтезировать сам. Некоторых витаминов, например витамина С (аскорбиновая кислота), в обычной пище человека не хватает, а животные получают их достаточно с растительным кормом.

Многие витамины проще выделять из природных источников или синтезировать химически. Но некоторые витамины могут быть дешево получены с помощью микроорганизмов или же в достаточном количестве содержаться в кормовых белковых добавках, таких, как дрожжи. С помощью микроорганизмов-сверхпродуцентов получают витамины - В₂ (рибофлавин), B₁₂ и бета-каротин (в организме из него образуется витамин А). Для производства рибофлавина используют уже давно известный грибок Эремотециум эшби, который и в природе (по непонятным пока причинам) синтезирует и выделяет огромные количества этого витамина. Сейчас в нашей стране выведены штаммы и разработана технология, позволяющая получать этот витамин с еще большей эффективностью из сенной палочки. Кроме получения готовых витаминов, микроорганизмы или выделенные из них ферменты иногда используют для проведения некоторых стадий синтеза витаминов. Предполагается, что в период с 1980 по 1990 г. производство витаминов в мире возрастет почти в 1,5 раза.

С помощью микроорганизмов получают важные органические кислоты, такие, как уксусная кислота, лимонная, молочная. Однако производство уксусной кислоты для промышленности дешевле вести химическим путем, а уксуснокислое брожение используют только для получения пищевого уксуса. Лимонную кислоту получают с помощью плесневого грибка аспергиллиум, молочную - с помощью молочнокислых бактерий. Ведется работа по удешевлению производства за счет использования более дешевых углеводов, таких, как отходы лесной промышленности. Для этого предполагалось, например, ввести в грибки ген фермента целлюлозы, с тем чтобы использовать целлюлозу - углевод, составляющий основную часть древесины.

Исключительную роль играют микроорганизмы в производстве антибиотиков. Антибиотики сейчас применяют не только как лекарства, но иногда и как пищевые добавки в рационе сельскохозяйственных животных, например птиц. В последние годы этот экономически выгодный прием подвергается серьезной критике, так как возникают штаммы бактерий, устойчивые к антибиотикам. В итоге это может привести к тому, что некоторые инфекционные болезни человека перестанут излечиваться антибиотиками.

Сейчас известно около 6000 различных антибиотиков, из которых реально производят около 100. Ежегодно обнаруживают более 300 новых антибиотиков, но только очень немногие из них оказываются настолько лучше существующих, что их имеет смысл запускать в производство. Однако такая работа все время продолжается, потому что болезнетворные бактерии быстро приспосабливаются к антибиотикам, и те становятся неэффективными. Среди некоторых болезнетворных бактерий недавно появились такие штаммы, которые не поддаются даже и новым антибиотикам и представляют серьезную медицинскую проблему.

В странах Запада сейчас производят около 30 тыс. т антибиотиков на сумму более 4,2 млрд. долл. Около 90% всех антибиотиков составляют пенициллин, тетрациклин и их варианты. Эффективность микроорганизмов, как продуцентов антибиотиков существенно повышается в ходе непрерывной селекции и получения искусственных мутаций после действия рентгеновских лучей, ультрафиолетового облучения, химических мутагенов. Так, за 20 лет селекции грибка пенициллиума синтез пенициллина в нем увеличился более чем в 300 раз и достиг 20 г/л суспензии вместо исходных 60 мг/л. Современные методы генетики микроорганизмов позволили бы получить такие продуценты значительно раньше - за 3-5 лет.

Микробиологическая индустрия производит много различных ферментов, применяемых в разных областях промышленности, прежде всего пищевой. Только один протеолитический фермент папаин, используемый для смягчения мяса, получают из тропического растения папай. Все же остальные выделяют из микроорганизмов. Это различные протеазы, глютамазы, амилазы, переваривающие крахмал, и глюкозоизомераза, превращающая 50% глюкозы во фруктозу. Приблизительно из 2000 известных сегодня ферментов в промышленности используют около 200.

Для получения ферментов специально созданы генетические штаммы микроорганизмов со значительно большей ферментативной активностью. Так, выход амилазы, выделяемой из сенной палочки благодаря мутациям, селекции, а также генно-инженерным манипуляциям, увеличен в 200 раз и более и достигает 5 г/л. Сейчас в эту бактерию ввели гены амилазы из термофильных бактерий, в результате чего их амилаза сможет работать при высоких температурах, что значительно ускорит катализируемый ею процесс расщепления крахмала до глюкозы.

В США с помощью ферментов из кукурузы вырабатывают 2 млн. т фруктозного сиропа. Для этого кукурузный крахмал последовательно обрабатывают тремя ферментами: амилазой и глюкамилазой для получения глюкозы и глюкозоизомеразой, которая превращает половину глюкозы во фруктозу. Так как фруктоза вдвое слаще сахарозы, ее использование в кондитерской промышленности и в быту позволяет значительно уменьшить употребление сахара, вредного в больших количествах для здоровья. Если фруктозу отделять от глюкозы, то оставшуюся глюкозу можно снова превращать во фруктозу. Так организовано получение больших количеств дешевой фруктозы, заменяющей сахар. В связи с этим в США, например, производство глюкозно-фруктозного кукурузного сиропа резко возросло, а употребление сахара быстро снижается. Кроме того, в практику входит малокалорийный заменитель сахара - аспартам, который производят с помощью микроорганизмов и ферментов из двух аминокислот - аспартата и фенилаланина. Сейчас производство аспартама налаживается и в нашей стране.

Ферменты используют и в медицине для многих диагностических тестов и даже в производстве пластиков. Так, исходный субстрат для их производства пропилен-оксид сейчас синтезируют с помощью трех ферментов, а не химическим путем, как до сих пор.

Иной в настоящее время становится и технология применения ферментов. Их все чаще используют в иммобилизованном виде, т. е. молекулу ферментного белка присоединяют почти без потери каталитических способностей к твердому носителю, например к полисахаридам (См.: Березин И. В., Яцимирекий А. К. Биотехнология и ее перспективы, - М.: Знание (серия "Биология"), 1986). В таком виде фермент сохраняется и функционирует в сотни и тысячи раз дольше, и нет необходимости избавляться от него в конце реакции. Глюкозно-фруктозный сироп из кукурузного крахмала производят как раз с помощью иммобилизованных ферментов. Иногда более эффективно иммобилизовывать не молекулы ферментов, а целые бактерии, способные осуществлять не одну, а последовательный ряд химических реакций. При участии таких микроорганизмов синтез кортизона для медицинских целей сокращен с 27 до 11 ступеней, а его цена упала в 30 раз.

Микроорганизмы, замурованные в желеобразную среду, могут существовать и работать месяцами и осуществлять сложные химические превращения. Активность ферментов в бактериях повышают не только путем мутаций и селекции, но и направленно. Для этого в микроорганизмы вводят плазмиды с большим количеством генов соответствующего фермента. В других случаях гены из одних бактерий вводят в составе плазмид в другие бактерии, более активные или быстрее размножающиеся.

Не всегда целесообразно использовать микроорганизмы для получения чистых аминокислот, необходимых для корма скоту. Проще производить кормовые белки, например, из дрожжей и использовать их прямо как кормовую добавку, значительно улучшающую соотношение аминокислот, т. е. балансирующую рацион. Так, в СССР в 1982 г. было произведено 1 млн. т сухих дрожжей, которые содержат до 60% белка. Эти дрожжи были добавлены к 20 млн. т корма и привели к увеличению продукции мяса на 1 млн. т. Иными словами, получение 1 т дрожжей эквивалентно получению 1 т мяса, решающим здесь является вопрос о дешевых источниках углерода, который может быть усвоен микроорганизмами. До недавнего времени для этих целей широко использовали нефтепродукты. Однако экономическая эффективность их использования меняется в зависимости от колебаний в мире цен на нефть. Другой источник - природный газ метан, который или используют непосредственно, или окисляют до метанола, а он уже усваивается специфическими бактериями или дрожжами. Другим дешевым источником пищи для микроорганизмов могут служить целлюлоза и лигнин, которые получают из отходов лесной и бумажной промышленности.

По производству кормов из микроорганизмов СССР занимает первое место в мире. Стоимость этих белков пока выше, чем белков из сои, но по мере совершенствования технологии цена их все время снижается, и в ближайшие годы белки из микроорганизмов должны стать дешевле, чем из сои. В нашей стране их использование было всегда экономически целесообразно.

В тропических странах в качестве кормового белка все больше применяют синезеленые водоросли. Первое место среди них занимает спируллина, которую использовали еще древние индейцы Мексики. Она способна жить в высокощелочной среде. Ее ежегодно добывают в больших количествах в Мексике из озера Тексома и в Африке из озера Чад. Содержание метионина и триптофана в спируллине больше, чем в белке молока казеине, а вот лизина относительно мало. Добыча спируллины в Мексике удваивается каждые пять лет и оттуда в виде сухого порошка ее экспортируют в США, Японию и Европу. Ее не только добывают из естественных теплых водоемов, но и разводят в искусственных условиях. В Италии, например, на специальной плантации из полиэтиленовых труб из спируллины получают 20 г сухого белка в день с 1 м² поверхности. В расчете на год ее продуктивность в 10 раз выше (по сухому весу), чем пшеницы, а по белку - в 10 раз выше, чем сои. Водоросли как корм для скота и как удобрение для хлопка используют и у нас в Средней Азии - там, где для этого есть подходящие водоемы.

Микроорганизмы все шире применяют для освобождения от многих органических отходов, загрязняющих окружающую среду. Благодаря микробиологической переработке таких отходов удается все в большей мере решать эту серьезную проблему. Однако некоторые вещества, такие, как изделия из пластмассы и полимерные пленки, не усваиваются микроорганизмами. Их переработка все еще остается серьезной проблемой. Во многих лабораториях идет поиск и создание микроорганизмов, способных разрушать полимеры. Иногда в литературе появляются сообщения о таких находках, но достаточно эффективного организма для решения этой задачи еще не найдено.

Микроорганизмы используют и для решения энергетических проблем, стоящих перед человечеством. До того, как научились использовать атомную энергию, единственным источником энергии на Земле было Солнце, благодаря которому возникли ископаемые источники энергии (нефть и уголь). Часть солнечной энергии, падающей на Землю, усваивают посредством фотосинтеза зеленые растения и фотосинтезирующие микроорганизмы.

Масса растений на Земле составляет приблизительно 1800 млрд. т, что по энергетическим возможностям равно примерно всем запасам ископаемого топлива. За год на Земле создается за счет фотосинтеза около 173 млрд. т сухого вещества, что в 20 раз превышает количество энергии, получаемой путем сжигания нефти, угля и газа. Используется же лишь небольшая часть этой биомассы в виде леса, причем площадь лесов все время сокращается. Таким образом, люди не используют огромное количество потенциальной энергии, которое в принципе доступно. Однако кроме сжигания, существуют и другие возможности утилизации энергии фотосинтеза - путем биологической конверсии зеленой массы в такие вещества, как этанол, метанол или метан, а затем использования их в качестве горючего.

Этиловый спирт (этанол) раньше получали исключительно в результате спиртового брожения продуктов, содержащих сахар или крахмал. Затем стало возрастать химическое производство спирта из этилена, но повышение цен на нефть снова сделало экономически выгодным спиртовое брожение. В качестве сырья для производства спирта используют растения с большим содержанием крахмала или сахаристых веществ. В тропических странах - это сахарный тростник, кассава, кукуруза, сладкий картофель, в странах с умеренным климатом - картофель и сахарная свекла. Однако использование этих продуктов как источника спирта для его последующего сжигания в двигателях вряд ли станет когда-либо экономически выгодным. В тропических странах решение вопроса об использовании спирта как источника энергии зависит, с одной стороны, от цены на нефть и газ, а с другой, на источники углеводов - кукурузу, кассаву, сахарный тростник. Но целесообразно ли использовать эти продукты сельского хозяйства не для питания, а для производства энергии?

В этой связи интересно решение, принятое в Бразилии в условиях повышения цен на нефть и снижения цен на сахар, Получать и использовать этиловый спирт в качестве горючего для автомобилей. Урожайность сахарного тростника возросла к настоящему времени в 3 раза (до 150 ц/га), что эквивалентно производству с 1 га почти 100 гл этанола. Кроме сахарного тростника, спирт делают из кассавы, которая в отличие от сахарного тростника растет в Бразилии круглый год. 20% спирта добавляют к бензину без переделки двигателей, но, видимо, можно добавлять и больше после небольшой их переделки. Этот бразильский проект сейчас рассматривают и другие страны со сходными природными условиями Латинской Америки, Африки, Океании.

Другой источник энергии, получаемой с помощью микроорганизмов, - производство биогаза - смеси метана (65%) и углекислого газа. Производство биогаза оказывается выгодным там, где имеется много растительных отходов и навоза. Биогаз производится в специальных, очень несложных сооружениях - контейнерах, в которые закладывают навоз, отходы от сахарного тростника, бананов, маниоки и другие неиспользуемые продукты сельского хозяйства. В контейнер помещают также специальную культуру бактерий, осуществляющих биометаногенез. Биогаз собирают в течение двух-четырех недель, выводят через отверстие вверху контейнера и используют в основном для обогрева и приготовления пищи.

Метан в таких контейнерах образуется в несколько этапов, каждый из которых осуществляется определенным видом бактерий. Сначала гидролизуют органические соединения (в обычных условиях не более половины всех отходов), затем ацидогенные бактерии образуют уксусную кислоту, водород и углекислый газ и на третьем этапе метаногенные бактерии используют эти вещества для производства метана. Ацетогенные и метаногенные бактерии образуют симбиотическое сообщество, которое раньше ошибочно считали одним микроорганизмом - метанобациллус. Производство биогаза служит одновременно и средством переработки отходов и их обеззараживания. После образования биогаза остатки используют как удобрение.

В Индии создано более миллиона установок для биогаза, которые перерабатывают навоз только, от 5% коров. В принципе 3-5 коров могут обеспечить потребности в биогазе для небольшой семьи из такого же количества людей. Десятки миллионов установок для биогаза сооружаются в Китае, около 70% крестьянских семей обеспечивают таким путем свои энергетические потребности. Установка для биогаза окупается через 8 лет и одновременно решает проблемы энергии, удобрения и ликвидации отходов.

Большие усилия ученых направлены на то, чтобы использовать энергию солнечных лучей непосредственно через искусственные системы фотосинтеза. Такая установка должна содержать хлорофилл из растений и разлагать воду под действием света на водород и кислород. Преимущества этой системы - ее чистота и безграничность ресурсов (вода и свет). Теоретически ее эффективность оценивается в следующих цифрах: за один солнечный день на 1 м² поверхности для фотолиза воды может быть использовано 100 Вт солнечной энергии, что дает 90 м³ водорода или 3 кг Н₂/год/м². В принципе установка площадью 30 м² может обеспечить одного человека всей необходимой ему энергией для света, обогрева и приготовления пищи. В действительности все это пока далеко от реализации - хлорофилл и гидрогеназы в подобных искусственных системах нестабильны, н все это можно рассматривать лишь как один из проектов будущего.

Итак, на смену биотехнологии, созданной ранее без серьезной научной основы, со второй половины нашего столетия пришла и все большую роль играет биотехнология, создаваемая на базе науки. В ее основе лежат методы генетики и селекции, позволяющие получать высокопроизводительные породы животных, сорта растений и штаммы микроорганизмов. С этой целью используют случайные генетические изменения - мутации, накопленные в предыдущих поколениях или вызванные искусственно. Как показывает опыт, возможности этих методов очень велики, хотя и не безграничны. Однако получение некоторых желаемых свойств таким путем, особенно если речь идет о растениях и животных, оказывается очень медленным.

Новые широкие перспективы дальнейшего развития биотехнологии стали видны после создания в начале 70-х годов методов генетической инженерии, основанной, в свою очередь, на достижениях молекулярной биологии. Практические задачи, решенные с помощью методов генетической инженерии, а также клеточной инженерии, пока не очень велики. В отличие от методов обычной генетики они основаны на иной методологии. Это не отбор (пусть строго направленный) случайно или ранее возникших генетических изменений и их комбинирование, а сознательное создание рекомбинантных ДНК, т. е. конструирование или даже синтез генетических элементов, обладающих известными свойствами.

Прежде чем рассмотреть методы генетической и клеточной инженерии и пути их использования, кратко расскажем об относительно новых достижениях молекулярной биологии, касающихся строения и функции молекул ДНК в клетках прокариотических (микроорганизмы, в основном бактерии) и эукариотических (ДНК собрана в хромосомы и локализована в ядре) организмов.

Источник: Нейфах А.А. Клеточные и генетические основы биотехнологии. - М.: Знание (серия "Биология"), 1987.