СОДЕРЖАНИЕ Введение Первобытная биотехнология - основа цивилизации Успехи "домолекулярной" биотехнологии Микроорганизмы - продуценты веществ и энергии Некоторые сведения из молекулярной биологии Принципы и методы генетической инженерии Инженерия клеток Биотехнология синтеза белков человека Перенос генов в клетки животных и растений Заключение Литература [показать] Основные направления экономического и социального развития СССР на 1986-1990 годы и на период до 2000 года. - М.: Политиздат, 1986. Биология развития и управление наследственностью / Отв. редактор член-корреспондент АН СССР В. А. Струнников. - М.: Наука, 1986. Биотехнология / Под ред. академика А. А. Баева. - М.; Наука, 1984. Биотехнология. Подписной теоретический и научно-практический журнал Министерства медицинской и микробиологической промышленности СССР. Выходит с 1985 г. Беккер М. Е. Введение в биотехнологию. - М.: Пищевая промышленность, 1978. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Проблема сохранения генофонда. - М.: Знание (серия "Биология"), 1985. Березин Й. В., Яцимирский А. К. Биотехнология и ее перспективы, - М.: Знание (серия "Биология"), 1986. ДубиниЙ Н. П. Очерки о генетике. - М.: Советская Россия, 1985. Достижения биологии - Продовольственной программе, - М.: Знание (серий "Биология"), 1984. Пехов А. П. Биология и научно-технический прогресс. - М.: Знание (серия "Биология"), 1984, Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии. - М.: Мир, 1984. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. - М.: Мир, 1983.

В брошюре рассказывается о научных предпосылках биотехнологии - успехах в изучении биологии клетки, строения и функций генетического аппарата и о путях использования этих теоретических знаний в решении практических задач, важных для сельского хозяйства, биологической промышленности и медицины. Рассматриваются основные направления современной биотехнологии, ее близкие и далекие перспективы. НЕЙФАХ Александр Александрович - доктор биологических наук, главный научный сотрудник Института биологии развития АН СССР. Автор открытия периодичности морфогенетической функции ядер (1962 г.) и более 150 научных работ и 5 книг по вопросам молекулярной биологии развития, изданных у нас и за рубежом. Рецензент Н.Г. Xрущов, член-корреспондент АН СССР.

Некоторые сведения из молекулярной биологии

Рождение молекулярной биологии принято датировать апрелем 1953 г., когда в английском журнале "Нейчер" появилась статья Дж. Уотсона и Ф. Крика, в которой предлагалась модель пространственного строения ДНК, основанная на рентгеноструктурном анализе и объясняющая уникальную способность этой молекулы к самоудвоению, репликации.

Молекула ДНК состоит из двух полимерных цепочек, образованных последовательным рядом нуклеотидов. В состав каждого нуклеотида входит сложная химическая группа - основание. В ДНК чередуются в различном порядке четыре вида оснований: аденин, тимин, гуанин и цитидин.

Особенность строения ДНК, отличающая ее от всех других молекул, состоит в наличии двух комплементарных друг другу цепей, совместно образующих двуспиральную структуру. Комплементарность состоит в том, что между двумя определенными рядом лежащими в соседних цепочках основаниями возникают не очень прочные водородные связи. Аденин (А) комплементарен тимину (Т), а гуанин (Г) - цитидину (Ц). Благодаря такой комплементарности последовательность нуклеотидов в одной цепочке ДНК однозначно определяет последовательность в другой. Это объясняет и принцип удвоения ДНК: при расхождении двух цепей против каждая из них может образоваться вторая, комплементарная ей, и в результате из одной двойной цепочки возникают две двойные и тождественные друг другу.

Функция ДНК - передача содержащейся в ней генетической информации - осуществляется посредством той же комплементарности: на гене рядом с одной из нитей ДНК синтезируется вторая нить, но уже не ДНК, а РНК, несущая почти такую же (вместо тимина она содержит похожий урацил) последовательность нуклеотидов, что и вторая цепь ДНК.

Общие принципы молекулярной биологии сейчас изучают в школе. Тем не менее есть смысл напомнить о них (хотя бы конспективно). Наследованные свойства зашифрованы на ДНК в виде порядка нуклеотидов, который кодирует чередование аминокислот в белках, что и определяет их свойства. Один ген кодирует один белок.

Все наследуемые признаки, как бы просты или сложны они ни были, реализуются только через синтез соответствующих белков. Первый этап такой реализации, или экспрессии, генов - процесс транскрипции, т. е. синтез РНК на ДНК, когда определенное расположение дезоксирибонуклеотидов в ДНК перекодируется в порядок рибонуклеотидов в РНК. Синтез белка на РНК, называемый трансляцией, происходит на рибосомах. Он состоит в том, что по мере продвижения матричной РНК через рибосому на ней образуется полипептид - цепь аминокислот. Каждые три нуклеотида кодируют одну из 20 аминокислот. Таким образом, в принципе цепочка РНК кодирующая один белок, содержит втрое больше нуклеотидов, чем в белке аминокислот. (В действительности нуклеотидов несколько больше, так как часть нуклеотидов на обоих концах мРНК не транслируется.) Размер гена (опять-таки в принципе) равен размеру мРНК с той разницей, что РНК - это одиночная цепочку, а ДНК в гене - двойная. У эукариот, однако, дело обстоит несколько сложнее, но мы опускаем здесь многие очень важные детали этой общей картины, поскольку они нам не понадобится в дальнейшем.

Водородные связи, сближающие два комплементарных нуклеотида - слабые, поэтому они не могут удержать вместе две цепочки ДНК. Для этого необходимо, чтобы комплементарными в двух цепях была не одна пара, а достаточно длинный участок, (не менее 16 пар). Этим создается возможность для манипуляций с молекулами ДНК и РНК. Если фрагменты ДНК нагреть до 80-90 °С, водородные связи разрываются и комплементарные нити ДНК отрываются друг от друга: ДНК денатурирует. При небольшом охлаждении такого раствора (до 65 °С) возможна ренатурация - соединение двух комплементарных нитей снова в двойную спираль. При этом могут соединяться нити из ДНК разного происхождения, если они имеют достаточно протяженные (не менее 16 нуклеотидов) участки, комплементарные друг другу. Вероятность того, что комплементарность оказалась случайной, очень мала (для участка из 10 нуклеотидов - одна миллионная). Следовательно, комплементарность (сходство) различных ДНК свидетельствует об их общем эволюционном происхождении.

Аналогичным образом могут соединяться нити ДНК и РНК. Это не может быть случайностью, а свидетельствует о том, что данная РНК была синтезирована на такой же ДНК, т. е. со своего собственного или с аналогичного, очень похожего гена. Таким образом, метод гибридизации молекул - соединение различных ДНК или ДНК и РНК по принципу комплементарности позволяет выявлять одинаковые или сходные гены либо гены и продукты их синтеза.

У прокариот ДНК обычно образует одно большое кольцо или, как говорят, одну кольцевую хромосому. Гены в такой бактериальной хромосоме расположены почти вплотную, один за другим, и разделены относительно небольшими регуляторными участками. Первые 35 пар нуклеотидов, непосредственно прилегающие к гену, называют промотором. Часто один регуляторный участок контролирует несколько генов, следующих друг за другом и определяющих одну физиологическую функцию, например усвоение молочного сахара - лактозы.

У бактерий, кроме основной кольцевой хромосомы, а также у одноклеточных эукариот дрожжей, некоторые признаки могут определяться маленькими колечками ДНК-плазмидами.

Хотя плазмиды содержат немного генов, они могут играть решающую роль в жизни клетки, когда она оказывается в критической ситуации. Некоторые из этих генов определяют устойчивость клетки к антибиотикам или тяжелым металлам. Плазмиды способны проникать в клетку из внешней среды, покидать клетку - теряться. Поэтому стабильное сохранение плазмиды в бактериальной клетке возможно тогда, когда плазмида содержит необходимые клетке гены, например обеспечивающие устойчивость к какому-либо антибиотику. Тогда в присутствии этого антибиотика в колонии сохраняются только клетки, несущие эту плазмиду.

Строение генов у эукариот значительно сложнее, и ДНК у них всегда больше. Она разделена между несколькими настоящими хромосомами, в которых прочно связана с белками. Когда удалось определить количество генов в организме некоторых эукариот, то оказалось, что ДНК собственно генов составляет лишь небольшую часть всей ДНК (от 2 до 10%). Остальная "избыточная" ДНК играет иную, пока не до конца понятную роль. Часть этой "избыточной" ДНК располагается внутри генов, как бы разрывая их на несколько частей. Такие гены состоят из экзонов - участков, кодирующих части белковой молекулы, и разделяющих их интронов - некодирующих последовательностей, которые по длине значительно больше экзонов. Из-за них общая длина гена оказывается больше, чем можно было бы предположить, в 5-7 раз. При транскрипции с такого гена считывается одна большая молекула РНК, которая затем (еще в ядре) подвергается сплайсингу - процессу вырезания некодирующих участков, транскрибированных с интронов, и сшиванию нескольких экзонных участков в одну молекулу мРНК уже гораздо меньших размеров.

Избыточность ДНК создается и за счет того, что гены у эукариот отделены друг от друга огромными разделяющими их участками - спейсерами. Предполагают, что значительная избыточность ДНК у эукариот важна для правильной организации структуры и регуляции функции отдельных генов в составе целой хромосомы. В начале гена находятся участки, которые обеспечивают правильную регуляцию работы генов. Эти участки можно разделить на две группы: неспецифические, одинаковые у всех генов, и специфические, характерные только для данного гена. Неспецифические регуляторные участки у эукариот называют "ТАТА-бокс" потому, что они всегда начинаются с чередования тимина (Т) и аденина (А). Этот участок лежит на 30 нуклеотидов выше (или левее) начала считывания гена. Сейчас установлено, что фермент транскрипции (РНК-полимераза) ложится на ДHK так, что одна его часть - опознающая - закрывает ТАТА-бокс, а другая - активный центр РНК-полимеразы - оказывается как раз над первым считываемым нуклеотидом. Таким образом, смысл ТАТА-бокса очевиден - он определяет правильное начало считывания. Так как ТАТА-боксы у всех генов одинаковые, то они не могут быть ответственными за включение и выключение разных генов в разных клетках.

Участки, отвечающие за специфическую регуляцию включения гена, называют у эукариот энхансеры (усилители). Они располагаются обычно тоже впереди гена, на расстояниях в сотни и даже иногда тысячи пар нуклеотидов. Энхансеры у разных генов различны и по размерам (обычно порядка нескольких десятков нуклеотидов), и по последовательности нуклеотидов. В клетках эукариот существуют специальные регуляторные белки, которые способны опознавать энхансеры своих генов, присоединяться к ним и этим активировать ген, т. е. включать его, делать способным к транскрипции. Механизм этот пока неясен и прежде всего непонятно, как включенный или невключенный энхансер может регулировать транскрипцию гена, находясь от него на значительном расстоянии. Согласно последним представлениям это достигается путем изменения дополнительной закрученности (сверхспирализации) ДНК, способной передаваться на значительное расстояние вдоль ДНК и менять ее конфигурацию так, что ее ТАТА-бокс становится доступным для РНК-полимеразы. По другим предположениям ДНК может изгибаться так, что белок, присоединенный к энхансеру, соприкасается с белком, присоединенным к ТАТА-боксу, и активирует его.

Структура молекулы ДНК не так стабильна и неизменна, как это раньше представляли. Очень сложный процесс удвоения ДНК, ее способность восстанавливать частые повреждения структуры, участие ДНК в процессах кроссинговера, когда хромосомы разрываются и сшиваются вновь, встраивание в состав хромосомы вирусной ДНК и, наконец, не очень редкие перемещения участков хромосомы вдоль нее - все это осуществляется при участии группы ферментов. Они способны разрезать ДНК, сшивать эти разрезы, создавать сверхспирализацию или снимать ее, синтезировать ДНК на ДНК, РНК на ДНК, и даже ДНК на РНК. Как мы увидим ниже, именно эти ферменты и используют в работах по генетической инженерии для аналогичных процедур.

Таковы те минимальные сведения о молекулярной биологии, знание которых необходимо, чтобы начать разговор о генетической инженерии и об ее использовании в новой биотехнологии.

Источник: Нейфах А.А. Клеточные и генетические основы биотехнологии. - М.: Знание (серия "Биология"), 1987.