СОДЕРЖАНИЕ Введение Первобытная биотехнология - основа цивилизации Успехи "домолекулярной" биотехнологии Микроорганизмы - продуценты веществ и энергии Некоторые сведения из молекулярной биологии Принципы и методы генетической инженерии Инженерия клеток Биотехнология синтеза белков человека Перенос генов в клетки животных и растений Заключение Литература [показать] Основные направления экономического и социального развития СССР на 1986-1990 годы и на период до 2000 года. - М.: Политиздат, 1986. Биология развития и управление наследственностью / Отв. редактор член-корреспондент АН СССР В. А. Струнников. - М.: Наука, 1986. Биотехнология / Под ред. академика А. А. Баева. - М.; Наука, 1984. Биотехнология. Подписной теоретический и научно-практический журнал Министерства медицинской и микробиологической промышленности СССР. Выходит с 1985 г. Беккер М. Е. Введение в биотехнологию. - М.: Пищевая промышленность, 1978. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Проблема сохранения генофонда. - М.: Знание (серия "Биология"), 1985. Березин Й. В., Яцимирский А. К. Биотехнология и ее перспективы, - М.: Знание (серия "Биология"), 1986. ДубиниЙ Н. П. Очерки о генетике. - М.: Советская Россия, 1985. Достижения биологии - Продовольственной программе, - М.: Знание (серий "Биология"), 1984. Пехов А. П. Биология и научно-технический прогресс. - М.: Знание (серия "Биология"), 1984, Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии. - М.: Мир, 1984. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. - М.: Мир, 1983.

В брошюре рассказывается о научных предпосылках биотехнологии - успехах в изучении биологии клетки, строения и функций генетического аппарата и о путях использования этих теоретических знаний в решении практических задач, важных для сельского хозяйства, биологической промышленности и медицины. Рассматриваются основные направления современной биотехнологии, ее близкие и далекие перспективы. НЕЙФАХ Александр Александрович - доктор биологических наук, главный научный сотрудник Института биологии развития АН СССР. Автор открытия периодичности морфогенетической функции ядер (1962 г.) и более 150 научных работ и 5 книг по вопросам молекулярной биологии развития, изданных у нас и за рубежом. Рецензент Н.Г. Xрущов, член-корреспондент АН СССР.

Принципы и методы генетической инженерии

Задачей генетической инженерии является выделение отдельных генов, их молекулярное клонирование и создание рекомбинантной ДНК - искусственной комбинации из генов и различных промоторов. Далее обычно пытаются обнаружить экспрессию этих генов, т. е. транскрипцию и трансляцию. Рассмотрим сначала первый этап этой работы - выделение и клонирование генов. Инструментами в этой работе, как уже говорилось, служат особые ферменты, которые получают из самых различных источников - бактерий, клеток млекопитающих и птиц, выращиваемых в культуре и зараженных разными вирусами, и т.д. В основном используют три вида ферментов: рестриктазы, лигазу и обратную транскриптазу.

• Рестриктазы - это разновидность дезоксирибонуклеаз, ферментов, разрезающих ДНК на короткие или длинные отрезки или даже на отдельные нуклеотиды. Особенность рестриктаз состоит в том, что они разрезают ДНК не в любом месте, а только между определенными нуклеотидами в участке со строго характерной для каждой рестриктазы последовательностью нуклеотидов. Обычно это 4-6 пар нуклеотидов, но разные рестриктазы отличаются именно порядком нуклеотидов в месте разреза. Например, рестриктаза ЕcoR1 расщепляет-ДНК в участке ГААТТЦ, а рестриктаза BamH1 - в учаотке ГГАТЦЦ. Сейчас известно более сотни различных последовательностей, которые "узнаются" различными рестрнктазами. При случайном распределении нуклеотидов вдоль ДНК вероятность нахождения последовательности из четырех определенных нуклеотидов составляет 1/256, а из шести - 1/4096. Поэтому рестриктазы разрезают ДНК на куски, состоящие из нескольких сотен или тысяч пар нуклеотидов.
• Лигаза - фермент, сшивающий свободные концы ДНК между собой. Этот фермент в нормальных клетках участвует в синтезе ДНК и в процессах ее репарации, т. е. восстановления нормальной структуры ДНК после ее частичного повреждения.
• Обратная транскриптаза - фермент, аналогичный ДНК-полимеразе, но синтезирующий ДНК не на ДНК, а на РНК. Этот фермент по сравнению с РНК-полимеразой работает как бы в обратном направлении, т. е. не от ДНК к РНК, а от РНК к ДНК. Есть ли обратная транскриптаза в нормальных клетках и происходит ли в них синтез ДНК на РНК - вопрос спорный и пока еще окончательно не решенный. Но этот фермент появляется в клетках эукариот при заражении их вирусами, содержащими РНК и размножающимися через ДНК. Геном этих вирусов кодирует обратную транскриптазу, с помощью которой образуется вирусная ДНК-матрица, на которой затем происходит синтез многих молекул вирусных РНК.

Первый этап клонирования какого-либо гена - получение "библиотеки" генов и отыскание в ее составе нужного нам гена, например гена человека, кодирующего один из глобинов - белков, образующих в эритроцитах гемоглобин. Получение "библиотеки" генов начинается с разрезания изучаемой ДНК (в нашем примере ДНК человека) на множество фрагментов. Число таких фрагментов зависит от выбранной рестриктазы. Для того, чтобы получить фрагменты, содержащие отдельные гены, нужно разрезать ДНК на несколько десятков или даже сотен тысяч фрагментов. Чтобы отделить гены друг от друга, используют плазмиды, в составе которых фрагменты ДНК вводятся в другие клетки, обычно бактериальные. Такую плазмиду-переносчик называют вектором.

В качестве вектора обычно выбирают плазмиду, в которой содержится ген устойчивости к антибиотику, например ампицилину, к которому очень чувствительна кишечная палочка Е. coli. Такую плазмиду разрезают с помощью рестриктазы в одном определенном месте, смешивают со смесью фрагментов ДНК человека и добавляют лигазу, которая вновь сшивает разрезанные концы. Во многих случаях лигаза просто замыкает плазмиду снова в кольцо, но достаточно часто она сшивает свободные концы фрагментов ДНК со свободными концами ДНК плазмиды. В результате возникает множество кольцевых плазмид, в которые встроены различные фрагменты ДНК человека. Где-то среди них окажется и нужный нам ген одного из глобинов.

Затем этими плазмидами "заражают" кишечную палочку или другой вид клеток. Клетки высевают на питательную среду так, чтобы каждая бактериальная клетка лежала отдельно от других и могла образовать собственную колонию. Такие колонии не образуют бактерии, в которых не оказалось плазмиды, так как в среду добавляют тот самый антибиотик (ампицилин), от которого плазмида защищает. Но в некоторых бактериях окажутся те плазмиды, в которые никакой фрагмент ДНК не встроился. Такие колонии тоже удается исключить, так как включение чужих генов уменьшает устойчивость к другому антибиотику (тетрациклину), и далее выращивают только эти чувствительные колонии.

Каждая колония, образованная из одной бактериальной клетки, будет содержать только один вариант плазмид с каким-то одним фрагментом ДНК человека - тем, который случайно оказался в составе плазмиды, попавшей в исходную бактерию. Но так как колоний образуется очень много (обычно десятки тысяч), то в них в принципе должны быть представлены по отдельности все фрагменты ДНК, т. е. в нашем случае все гены человека. Конечно, такая "библиотека" получается в идеале. На самом же деле во многих плазмидах будут только фрагменты участков, не содержащие генов, в некоторых окажется только часть гена или два гена (это зависит от выбора рестриктазы). Но есть основания ожидать, что одна или несколько колоний будут содержать как раз ту плазмпду, в которую попал нужный нам ген в целом виде.

Хотя из такой "библиотеки" в принципе можно получить все гены человека, для этого нужно уметь их выделить, т. е. каждый раз отличить нужную нам колонию от всех остальных. Существуют различные способы выявления. Рассмотрим самый простой, пригодный как раз для глобиновых генов. Не очень сложно получить молодые клетки крови, будущие эритроциты, в которых очень интенсивно идет синтез глобинов, и глобиновая мРНК составляет более 80% всей мРНК. Если молекулы этой мРНК гибридизовать с ДНК бактерий, она образует гибрид только с той колонией, в которой оказался фрагмент ДНК, содержащий ген глобина. Гораздо чаще это делают иначе, через радиоактивно-меченую ДНК. Для этого мРНК глобина выдерживают вместе с обратной транскриптазой и радиоактивными нуклеотидами, так что синтезируется радиоактивная ДНК, являющаяся комплементарной копией мРНК. Такую ДНК называют кДНК. Радиоактивную глобиновую кДНК гибридизуют с разрушенными бактериями. В результате те очень немногие колонии, в которых гибридизация произойдет, легко обнаружить по их радиоактивности. Это и есть нужная нам колония, содержащая ген глобина человека.

После того как обнаружат колонию бактерий, содержащих плазмиду с нужным нам геном, его можно неограниченно клонировать. Для этого штамм бактерий размножают, выделяют из них плазмидную ДНК, а из нее (опять с помощью рестриктаз) - встроенный ген. Первую и еще не самую трудную часть работы на этом можно считать выполненной. Оставшуюся "библиотеку" можно использовать для выделения из нее других генов. Клонированный ген можно затем использовать в различных целях, например для его подробного изучения. Во многих работах гены подвергают секвенированию, т.е. изучению в них последовательности нуклеотидов. Такие данные очень нужны для сравнения с последовательностью нуклеотидов в аналогичных генах других животных или с другими генами, чтобы обнаружить их общее эволюционное происхождение.

Нам сейчас важнее рассмотреть другое - попытки заставить клонированный ген работать в бактериальной клетке. Работа гена, называемая экспрессией, состоит из транскрипции и трансляции. В самом простом случае фрагмент ДНК, содержащий ген, включает также и его регуляторную часть. Казалось бы, теперь можно ожидать, что транскрипция такого гена окажется возможной. Однако для генов эукариот такая возможность маловероятна, так как в бактериях нет тех регуляторных белков, которые способны включать эукариотические гены. Поэтому нужно удалить весь регуляторный участок эукариотического гена и заменить его на регуляторный участок бактериального гена или проще разрезать бактериальную ДНК на границе гена и промотора и вставить туда ген эукариот. Все эти манипуляции осуществляются также с помощью рестриктазы, способной разрезать ДНК в нужном месте, и лигазы, сшивающей места разреза. Так создают кольцевую ДНК, в которой соседствуют участки ДНК разного происхождения - плазмидного и человеческого. Такие ДНК называют рекомбинантными.

Конструирование хорошего промотора обеспечивает только первую часть экспрессии гена - его транскрипцию, т. е. синтез РНК. Но не менее важно обеспечить и вторую часть экспрессии - трансляцию, т. е. синтез белка. Здесь препятствием может оказаться отличие бактериальных рибосом от эукариотических. Дело в том, что не вся молекула мРНК кодирует последовательность аминокислот в белке. Ее начальный короткий участок служит для прикрепления к рибосоме, и для этого в нем имеется особая последовательность из нескольких нуклеотидов. Эта последовательность оказалась различной у эукарнот и у прокариот. Поэтому приходится помещать ген эукариот, который мы изучаем, после того участка бактериального гена, который важен для начала трансляции. Наконец, есть еще одно важное препятствие - неспособность бактерий к сплайсингу, т. е. вырезанию из только что синтезированной РНК эукариот тех некодирующих участков, которые были считаны с интронов. Один из путей преодоления этого препятствия - использование не настоящего гена, а его кДНК. Как уже говорилось, если взять мРНК, прошедшую сплайсинг, т.е. уже без интронов, и подвергнуть ее действию обратной транскриптазы, то синтезируется кДНК (копия гена эукарнот, но лишенная интронов). Экспрессия такого гена не нуждается в сплайсинге.

Предлагается также использовать для экспрессии клетки не бактерий, а эукариот, например дрожжей. Действительно можно поместить клонированный ген в плазмиду дрожжей и ввести его в эти простейшие, но все же эукариотические клетки, обладающие, в частности, ферментами сплайсинга. Однако пока попытки такого рода оказались неудачными - сплайсинг у дрожжей действительно есть, но он, очевидно, происходит иначе, чем у высших эукариот. Поэтому РНК, считанная с генов млекопитающих, в дрожжах правильного сплайсинга не проходит.

Все эти опыты легче вести тогда, когда существует способ отбора бактериальных клеток, в которых встроенный ген экспрессируется, от тех, в которых такой экспрессии почему-либо не происходит. Примером такого исследования служат опыты, в которых использовали фермент человека - дегидрофолатредуктазу. Этот фермент необходим для нормального синтеза нуклеиновых кислот. Однако существует ингибитор метотрексат, который этот фермент подавляет. Оказалось, что если взять кДНК с мРНК этого фермента и ввести его с плазмидой в бактериальную клетку, а в среду добавить немного ингибитора, то расти и делиться будут только те клетки, где синтез фермента так активен, что малые дозы ингибитора его подавить не могут. В результате отобрались лишь те клетки бактерий, где экспрессия гена человека была особенно интенсивной.

Трудности, связанные с экспрессией эукариотических генов в бактериальных клетках, заставляют исследователей искать иные пути и среди них - использование клеток млекопитающих в культуре ткани. Конечно, работать с ними намного сложнее, и первоначально клонировать гены все равно приходится в кишечной палочке с использованием бактериальных векторов - плазмид. Но зато потом удается ввести клонированный ген в клетки млекопитающих, например, путем микроинъекций. В другом варианте клонированные гены тоже путем микроинъекций вводят в яйцеклетки млекопитающих и из них выращивают целых животных, в геном которых встроены (интегрированы) клонированные гены. До сих пор это были только мыши, но сейчас уже получены кролики, свинки, овцы, в геном которых интегрированы чужеродные гены. Таких животных называют "трансгенными".

Ниже мы расскажем о тех опытах, в которых удалось успешно интегрировать в геноме мыши ген гормона роста крысы и получить синтез больших количеств гормона, который заметно увеличивал рост мышей. Экспериментаторам удалось найти для растений несколько плазмид, которые могут проникать из клеток особых бактерий в растительные клетки. Кроме плазмид, используют и другие векторы - переносчики генов. Иногда это вирусы эукариот или фаги бактерий. Есть попытки использовать для этой цели ДНК из митохондрий или хлоропластов - клеточных частиц, ответственных за энергетику и фотосинтез и имеющих собственную кольцевую ДНК.

Мы рассмотрели здесь только основные принципы методов генетической инженерии. Эти методы имеют множество вариантов, которые разрабатываются в десятках и сотнях лабораторий во многих странах мира и в нашей стране. Задача этих исследований - изучение строения генов и механизмов регуляции их экспрессии. Но многие из приемов генетической инженерии нашли свое применение и в практических целях для разработки новой биотехнологии.

Источник: Нейфах А.А. Клеточные и генетические основы биотехнологии. - М.: Знание (серия "Биология"), 1987.