Наследственные болезни - болезни, обусловленные повреждением наследственного аппарата (генома) клетки. Повреждения могут затрагивать весь геном, отдельные хромосомы и вызывать хромосомные болезни или касаться индивидуальных генов и быть причиной генных болезней.

Достаточно приблизительная оценка частоты таких нарушений в популяции, точнее у новорожденных, дает представление о величине генетического груза. Согласно существующему мнению [4], величина генетического груза в отечественной популяции равна примерно 5-5,5%, из которых 1% составляют генные болезни, 0,5% - хромосомные, а 3-3,5% приходится на болезни с выраженной генетической предрасположенностью. Следовательно, повреждения генома разной степени встречаются примерно у 1,5% всех новорожденных и вносят существенный вклад в показатели перинатальной патологии, ранней инвалидизации и смертности.

ХРОМОСОМНЫЕ БОЛЕЗНИ

Хромосомные болезни (ХБ) - группа заболеваний, вызванных числовыми или структурными аберрациями хромосом, видимыми в световой микроскоп [14]. Последнее уточнение вряд ли оправданно: по мере роста разрешающих возможностей цитогенетики, бурного развития ее нового направления - молекулярной цитогенетики, многие синдромы врожденных пороков развития с ранее не установленным типом наследования (синдром Видеманна-Беквита, Прадера-Вилли, де Ланге и др.) в действительности оказались типичными ХБ, обусловленными микроделециями разных хромосом.

ХБ - частая форма патологии. При безвыборочном популяционном анализе встречается с частотой 2,5-5,0 на 1000 новорожденных детей. Частота ХБ среди мертворожденных и детей, умерших в возрасте до года, на порядок выше и составляет 22 на 1000 [15]. Удельный вес ХБ среди плодов с множественными врожденными пороками развития, по данным патологоанатомических исследований, составляет 28,4% [14]. Самая высокая частота хромосомной патологии (до 70%) зарегистрирована в материалах ранних спонтанных абортов и так называемых пустых плодных мешках (blidhted ova - зародышевых пузырях, не содержащих частей собственно эмбриона) [20]. Следовательно, подавляющее большинство хромосомных аберраций у человека несовместимы даже с ранними этапами эмбриогенеза. Такие зародыши элиминируются во время имплантации (7-14-й дни развития), что клинически проявляется как задержка или выпадение цикла, или вскоре после имплантации (ранние спонтанные аборты). Лишь сравнительно немногие варианты числовых хромосомных нарушений совместимы с постнатальным развитием и ведут к ХБ. Рассмотрим их подробней.

ХБ являются следствием повреждений генома, возникающих при созревании половых клеток (гамет) в процессе оплодотворения овулировавшей яйцеклетки спермием, либо на ранних стадиях дробления оплодотворенной яйцеклетки.

Все ХБ могут быть подразделены на три большие группы:

1. Связанные с нарушениями плоидности [показать] .

   В постнатальном периоде нарушения плоидности представлены только триплоидией: истинная гаплоидия (n=23) у человека известна только на доимплантационных стадиях развития, тетраплоидия (n=92)описана лишь в материале спонтанных абортов.

   Одним из вариантов гаплоидии является партеногенетическое развитие, т.е. развитие, контролируемое только одним родительским геномом - материнским (гиногенез) или отцовским (андрогенез). Случаи спонтанного партеногенеза (гиногенеза) ооцитов описаны у человека, однако хромосомный анализ таких уникальных зародышей не проводился [9]. Тем удивительней оказался факт спонтанного андрогенеза, обнаруженный в конце 70-х годов при цитогенетическом, биохимическом, а позже и молекулярном анализе клеток опухолей, получивших название "пузырный занос" (hydatidiform mole). Обнаружено, что в подавляющем большинстве случаев эти опухоли (злокачественно перерожденные ворсинки хориона) содержат только отцовские хромосомы (геном) и не несут материнского набора. Причины столь быстрого озлокачествления клеток зародыша, содержащих только отцовский геном, остаются неизвестными [21].

   Триплоидия - наличие лишнего гаплоидного набора (n = 23) хромосом, при котором каждая хромосома представлена в трех экземплярах (n = 69). Триплоидия может возникать как вследствие дигинеи (наличия лишнего, нередуцированного во 2-й метафазе мейоза гаплоидного набора), так и вследствие диандрии (оплодотворение нормальной яйцеклетки двумя сперматозоидами или спермием с диплоидным числом хромосом). Развитие гиногенетических триплоидов (два материнских + один отцовский наборы хромосом) в целом происходит лучше, чем андрогенетических (один материнский + два отцовских набора хромосом). Они чаще достигают плодного периода и способны к живорождению.

   Дети с синдромом триплоидии рождаются с резко выраженной пренатальной гипоплазией (средняя масса тела около 2000 г) и имеют выраженные множественные пороки развития (расщелины губы и неба, синдактилия III и IV пальцев рук, микрофтальмия). Подробно с патологией развития при синдроме триплоидии можно ознакомиться в соответствующих справочных руководствах [11, 14]. Отметим только, что возникновение триплоидии не связано с возрастом родителей, и подавляющее большинство триплоидов (более 90%) элиминируется уже в 1-м триместре беременности.

2. Обусловленные нарушениями числа хромосом [показать] .

   Отклонение числа хромосом в кариотипе, некратное диплоидному, называют анэуплоидией (А). Она обычно возникает вследствие ошибок сегрегации хромосом в 1-м или во 2-м делениях мейоза при созревании гамет в процессе оогенеза и сперматогенеза. Реже А может быть следствием нерасхождения (утраты) отдельных хромосом во время первых делений дробления оплодотворенной яйцеклетки.

   В случае трисомин одна из хромосом представлена в трех экземплярах (2n = 47), при моносомии наблюдается полное отсутствие одного из гомологов (2n = 45).

   В постнатальном периоде встречается только моносомия X; отсутствие какой-либо из аутосом несовместимо с внеутробной жизнью. Трисомия, напротив, является наиболее часто встречающейся формой хромосомной патологии у человека [14]. Вместе с тем, как и в случае триплоидии, подавляющее большинство трисомиков по различным аутосомам человека отмирают в период активного органогенеза (14-72 дни развития) и абортируются уже в 1-м триместре беременности. Совместимы с живорождением трисомии хромосом 7, 8, 9, 13, 18, 21, 22 и трисомии гоносом - XXX; ХХУ; ХУУ.

   В клиническом плане наибольший интерес представляют трисомии аутосомы 13 (синдром Патау, частота 1:5 000 новорожденных), аутосомы 18 (синдром Эдвардса - частота 1:3000 новорожденных) и аутосомы 21 (болезнь Дауна - частота 1:650 новорожденных), а также все трисомии гоносом (частота - 1:800 новорожденных). Именно эти трисомии не только совместимы с живорождением, но и являются причинами столь частых ХБ, как болезнь Дауна (Тс21) и синдром Кляйнфельтера (ХХУ). Трисомии гоносом типа трипло-Х (XXX) или ХУУ обычно не ведут к четко очерченной клинической симптоматике.

   Болезнь Дауна (Тс21) - самая частая трисомия у человека. Приводит к характерному синдрому нарушений развития лицевого черепа, скелета, внутренних органов, подробно рассмотренных в многочисленных руководствах по медицинской генетике. В 90% всех случаев болезнь Дауна является результатом нерасхождения хромосомы 21 в процессе -оогенеза. Наличие удобных молекулярных маркеров позволяет в каждом случае определить, произошло ли нерасхождение в М1 или МII мейоза. Причины нерасхождения неясны. Этиологически особенно важными считаются внутри- и внефолликулярное перезревание яйцеклетки, нарушения (отсутствие) хиазм в 1-м делении мейоза, наличие хромосомной транслокации, вовлекающей хромосому 21 у одного из родителей (t 13/21; t 15/21 и даже t 21/21). В последнем случае все гаметы будут потенциально давать либо мопосомию хромосомы 21 (ранняя внутриутробная гибель), либо приводить к болезни Дауна.

   Провоцировать нерасхождение хромосомы 21 могут также увеличенные спутники акроцентрических хромосом, увеличенные блоки околоцентромерного гетерохроматина.

   Моносомия X (синдром Тернера)- встречается с частотой 1:3000 новорожденных. Считается, однако, что кариотип 45,X имеется почти у 5% всех зародышей при зачатии, причем утрата одной Х-хромосомы происходит во время первых делений дробления оплодотворенной яйцеклетки. Только одна из сорока ХО зигот доживает до рождения.

   Спектры клинических проявлении ХБ, обусловленных А различных хромосом, весьма многообразны н подробно изложены в соответствующих монографиях и руководствах по медицинской генетике и тератологии [8, 12, 14, 18].

   Хромосомный мозаицизм (ХМ)

   Хромосомный мозаицизм (ХМ) - наличие в организме нескольких клеточных клонов с различным (нередко аберрантным) кариотипом. Описан для многих аутосом, всех гоносом и даже для целых хромосомных наборов (2n/3n). Как правило, возникает на первых делениях дробления (мозаицизм хромосом, ограниченных хорионом) либо при формировании зародышевых листков на стадии бластоцисты - гаструлы, и в этом случае ХМ ограничен клетками какого-то одного зародышевого листка. ХМ возможен при слиянии продуктов двух и более зигот. В этом случае говорят о хромосомном химеризме.

   ХМ обычно ограничен лишь каким-то определенным типом тканей и потому далеко не всегда доступен диагностике. Поскольку кариотипирование в постнатальном периоде, как правило, ограничивается анализом стимулированных лимфоцитов периферической крови, нет сомнения в том, что многие случаи хромосомного мозаицизма даже при наличии врожденных пороков, остаются нераспознанными.

   Нередко ту или иную степень хромосомного мозаицизма обнаруживают и у пациентов с ХБ, особенно в случае синдрома Тернера [23, 24].

   Особенно труден для диагностики и важен для прогноза потомства так называемый гонадный мозаицизм: присутствие аберрантного хромосомного клона в гонадах (обычно в яичниках). Рождение в одной семье двух детей с болезнью Дауна (при отсутствии транслокационного варианта Тс21) позволяет с высокой степенью вероятности предположить наличие гонадного мозаицизма по хромосоме 21.

3. Вызванные нарушениями их структуры [показать] .

   Клинически и патоморфологически представляют собой очень пеструю группу ХБ (синдромов), в основе которой в подавляющем большинстве лежат частичные трисомии или частичные моносомии хромосом.

   Частичные трисомии и моносомии - результат структурных перестроек хромосом (транслокации, инверсии, дицентрические хромосомы), имеющихся в половых клетках, которые вследствие нарушения процессов спаривания гомологов и рекомбинации (кроссинговера) в мейозе закономерно приводят к утрате или к избытку фрагмента хромосом, вовлеченных в перестройку [9]. Реже частичные трисомии и моносомии являются результатом хромосомных мутаций в гаметогенезе. Эту специфическую особенность важно учитывать при генетическом консультировании таких семей.

   Известны частичные трисомии и моносомии практически по всем хромосомам. Однако лишь некоторые из них, а именно 4р, 4q, 7q, 9р, 10р, 10q, 11q, 12q и синдром "кошачьего глаза" формируют четко диагностируемые клинические синдромы. В настоящее время очерчивается еще ряд синдромов, связанных с частичными трисомиями - трисомии по коротким плечам хромосом 3, 5, 8, 11, 20, по длинным плечам хромосом 1, 3, 8, 9, 16, 18. Однако число наблюдений каждой из таких форм невелико, а обнаруживаемые пороки развития в основном присущи любому типу аутосомного дисбаланса [14].

   Фенотипические проявления синдромов частичных трисомий более полиморфны, чем синдромов целых трисомий. Отчасти это связано с тем, что размеры триплитированного фрагмента могут варьировать в каждом отдельном случае, а также с тем, что нередко в случае хромосомных транслокаций у родителей частичная трисомия по одной транслоцированной хромосоме может сочетаться с частичной моносомией - по другой. Наиболее частым синдромом частичных трисомии является синдром 9р+ (вторая по частоте форма аутосомного дисбаланса после болезни Дауна).

   Синдромы частичных аутосомных моносомии представлены синдромом Вольфа-Хиршхорна (4р-); синдромом "кошачьего крика" (5р-), 9р-; 11q-; синдромом Орбели (13q-); 18q-; 18р-; 21q-; 22q-.

   Подробно с клиническими проявлениями этих синдромов можно ознакомиться в соответствующих руководствах и монографиях по медицинской генетике [11, 12, 14, 15, 16].

Характерным для ХБ первых двух групп является гетероплоидное число хромосом, т. е. число хромосом, отличное от нормального - диплоидного (n=46), типичного для каждой соматической клетки.

Основные принципы анализа кариотипа человека

Обнаружение корреляций целого ряда заболеваний и врожденных дефектов в развитии человека с изменениями в его хромосомном наборе (кариотипе) стимулировало в середине 50-х годов XX века развитие новой области генетики - цитогенетики человека и ее подразделов - клинической цитогенетики, онкоцитогенетики, пренатальной цитогенетики.

Основной задачей клинической цитогенетики является анализ кариотипа у пациентов с различными (изолированными и множественными) врожденными пороками развития. Задачи онкоцитогенетики касаются исследования корреляций онкологического процесса с хромосомными аберрациями в опухолевых клетках.

Задачи пренатальной цитогенетики:

1. кариотипирование плодов человека на ранних стадиях эмбриогенеза с целью диагностики хромосомных болезней;
2. изучение функциональной активности отдельных хромосом или их сегментов и их влияния на процесс эмбриогенеза - т.е. цитогенетика эмбрионального развития человека.

К настоящему времени для описания кариотипа человека и хромосомных аберраций различного типа разработана Международная номенклатура хромосом, последняя редакция которой используется всеми специалистами в области цитогенетики человека с 1995 года [22].

Основные подходы к анализу кариотипа

По мере развития методов цитогенетического анализа их арсенал неуклонно увеличивался, и к настоящему времени возможно изучение всего хромосомного набора или отдельных хромосом в клетках практически любых тканей и органов, на любой стадии клеточного цикла, в митозе и мейозе. В зависимости от целей исследования различают методы исследования хромосом:

• прямые [показать] .

  Прямые методы исследования хромосом подразумевают приготовление препаратов из свежеполученного материала после специальной обработки. Эти методы применяются при исследовании тканей, обладающих высокой митотической активностью (костный мозг, клетки лимфатических узлов, ткани эмбриона на ранних стадиях развития и хорион/плацента на любом сроке беременности) и при исследовании мейотических хромосом.

• непрямые [показать] .

  Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после стимулирования пролиферации клеток в культуральных условиях в течение времени - от нескольких часов (кратковременные культуры) до нескольких лет (перевиваемые культуры).

  В зависимости от стадии клеточного цикла проводят исследования:

  • интерфазных ядер (половой хроматин в ядрах буккального эпителия, анализ гетероплоидии в интерфазных ядрах любых клеток методом гибридизации in situ);
  • профазных хромосом (анализ на стадии пахитены в сперматогенезе);
  • прометафазных хромосом (высокий уровень разрешения);
  • метафазных хромосом (традиционный анализ ФГА-стимулированных лимфоцитов и реже - клеток костного мозга, фибробластов кожи и др.);
  • стадий анафазы-телофазы (для регистрации специфического воздействия различных агентов на хромосомы методом оценки частоты клеток с мостами и фрагментами).

  В клинической цитогенетике широко применяются методы анализа буккального эпителия и лимфоцитов периферической крови.

Основные этапы анализа хромосом

Существует множество модификаций прямого и непрямого методов приготовления хромосомных препаратов. Однако при всем их разнообразии основные этапы получения метафазных пластинок, пригодных для анализа, остаются неизменными [показать] .

Применение всех этапов обработки материала существенно улучшает качество препаратов метафазных хромосом. Концентрации реагентов, температурные и временные режимы, способы нанесения материала на препарат и окраски хромосом могут варьировать. Наличие многочисленных вариантов и модификаций цитогенетических методов объясняется особенностями исследуемого материала, целями исследования и устоявшимися лабораторными традициями. Подробно методы приготовления и анализа хромосомных препаратов изложены в соответствующих руководствах [3, 10, 17, 27].

Краткая характеристика методов анализа хромосомных препаратов

В зависимости от задач исследования препараты хромосом можно анализировать одним из следующих способов [показать] .

Детальное описание основных методов дифференциальной окраски хромосом и метода гибридизации in situ приведено в соответствующей литературе [3, 10, 17, 27].

ГЕННЫЕ БОЛЕЗНИ (ГБ)

Причиной ГБ (генные или молекулярные, менделирующие, моногенные) являются мутации - изменения в структуре ДНК самих генов или в их регуляторных областях, приводящие к нарушениям их функции (экспрессии) и, как следствие этого, к появлению аномальных генопродуктов (белков) или к полной блокаде их синтеза.

В 11-м издании энциклопедии американского профессора Виктора Мак-Кьюсика содержатся сведения о 6678 картированных менделирующих локусах человека [25]. Из них 4458 генов с аутосомно-доминантным типом наследования, 1730 - с аутосомно-рецессивным, 412 генов, локализованных на Х-хромосоме, 19 - на У-хромосоме и 59 - в митохондриальных генах. Список заболеваний продолжает стремительно увеличиваться и в сочетании с быстро нарастающими данными о молекулярной структуре генома, идентификацией все новых генов и их мутантных аллелей создает уникальную возможность не только для точной диагностики ГБ, но и для их профилактики, а в недалеком будущем и для специфического лечения методами генной терапии.

К настоящему времени на хромосомах человека уже картировано около 1000 генов, мутации которых ведут к различным ГБ. Более половины из них клонированы, т.е. выделены в чистом виде и детально охарактеризованы методами ДНК-анализа. Для каждого из этих генов описаны многочисленные мутации, собственно и являющиеся молекулярной основой ГБ, и многочисленные полиморфные сайты как внутригенной локализации, так и лежащие в непосредственной близости от самого гена. Наличие идентифицируемых мутаций, в особенности мажорных, т.е. встречающихся особенно часто в определенных популяциях, и полиморфных сайтов, легко узнаваемых стандартными молекулярными методами анализа (полимеразная цепная реакция, эндонуклеазная рестрикция, электрофорез, блот-гибридизация и другие), открывает широкие возможности для ранней, в том числе и пренатальной, а также для досимптоматической диагностики таких заболеваний.

Типы наследования ГБ

ГБ передаются по следующим типам наследования: аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный и Х-сцепленный (преимущественно рецессивный). Последние, однако, нередко ведут себя как доминантные у особей мужского пола, где они оказываются в гемизиготном состоянии - наличие только одной копии мутантного гена на Х-хромосоме и отсутствие гомологичного аллеля на У-хромосоме. То же самое относится и к немногочисленным генам У-хромосомы - передача признака по мужской линии (голандрический тип наследования). Весьма многочисленная группа "митохондриальных" заболеваний наследуется исключительно по материнской липни, т.к. митохондрии передаются зародышу только через цитоплазму ооцита.

Важнейшим и простым диагностическим методом определения типа наследования ГБ является генеалогический метод, т.е. исследование родословной. Составление родословной пробанда (лица, обращающегося за медико-генетической консультацией), символы и принципы составления родословной приведены на рис. 14.1 и 14.2.

Для болезней с аутосомно-доминантным типом наследования характерно проявление мутантого гена (т.е. ГБ) в гетерозиготном состоянии (А/а, где А - доминантный (мутантный) аллель, а - рецессивный (нормальный) аллель). Вероятность наследования аутосомно-доминантной ГБ составляет 50%. На рис. 14.3 изображена родословная семьи, отдельные представители которой страдают аутосомно-доминантным заболеванием - хореей Гентингтона. Мутации гена гентингтина относятся к динамическому типу, а само заболевание - к группе болезней экспансии, молекулярные особенности которых рассмотрены ниже. Отметим только, что биохимическую основу многих доминантных мутаций составляет появление белков с новыми, несвойственными им функциями или потенциирование (усиление) уже существующих функций (gain-of-function).

При аутосомно-рецессивном типе наследования ГБ прослеживается по родословной родственников больного по горизонтали, т.к. мутантный ген может проявить себя только будучи в гомозиготном состоянии (b/b). Мальчики и девочки болеют одинаково часто, вероятность появления больного ребенка в семье фенотипически здоровых гетерозиготных носителей В/b (В - здоровый ген, а b - мутантный аллель) составляет 25%.

На рис. 14.4 представлена родословная семьи высокого риска болезни Вильсона-Коновалова (гепатолентикулярная дегенерация). Из 10 братьев и сестер трое оказались больными. Точкой отмечены гетерозиготные носители патологического гена [5].

На рис. 14.5 приведен пример наличия болезни Вильсона - Коновалова в двух поколениях. Интересно, что в данной семье больные дети рождались от брака больной (гомозиготы b/b) с ее дальним родственником (гетерозигота В/b), т.е. в данном случае имел место родственный брак. Многие наиболее частые тяжелые ГБ, такие как муковисцидоз, фенилкетонурия, поликистоз почек (рецессивная форма), адрено-генитальный синдром и др. наследуются именно по такому типу. Их биохимическую основу, как правило, составляет полная или частичная утрата функции специфического мутантного белка (loss-of-finction).

Наследственные болезни, сцепленные с X-хромосомой, при наличии доминантной мутации, прослеживаются в родословной по вертикали по материнской или отцовской линии. При наличии заболевания у отца - болеть будут все его дочери, но не сыновья; если больна мать, то независимо от пола больными окажется половина всех детей. При наличии рецессивных мутаций в Х-хромосоме женщины являются только носителями (кондукторами) патологического гена. Болеют только мальчики. Вероятность передачи заболевания составляет 50%.

На рис. 14.6 представлена родословная беременной М. (II₄), родной брат (II₁) которой умер от миодистрофии Дюшенна; у первого сына (III₃) также имеется манифестная форма миодистрофии Дюшенна, второму сыну (III₄) поставлен тот же диагноз в преклинической стадии во время ДНК-обследования семьи, плоду мужского пола поставлен диагноз миодистрофии Дюшенна ДНК-методами, и беременность была прервана. Такой тип наследования характерен также для таких распространенных болезней, как гемофилии А и В и отчасти синдром ломкой Х-хромосомы. В последнем случае, однако, в связи с наличием "динамического" типа мутаций наследование носит более сложный характер и может проявляться не только у мальчиков, у которых оно протекает особенно тяжело, но и у девочек, у которых болезнь может быть выражена в разной степени, т.е. имеет различную пенетрантность.

В случае "митохондриальных" болезней (мутации в митохондриальных генах) передача потомству происходит только по материнской линии и не зависит от пола ребенка. Больной отец не является трансмиттером заболеваний, таких как атрофия зрительного нерва Лебера, митохондриальная энцефалопатия, миоклональная эпилепсия и многие другие. Варьирование доли нормальных и "мутантных" митохондрий в различных органах и тканях, в том числе в гонадах (так называемая гетероплазмия митохондриальных мутаций), приводит к значительной клинической вариабельности митохондриальных болезней и существенно затрудняет их прогноз для потомства.

Классификация ГБ

Классификация ГБ существенно затруднена в связи с многообразием уже известных нозологии и быстрым появлением новых нозологических форм [25, 26]; отсутствием сведений о первичном биохимическом дефекте почти у 90% ГБ; многообразием клинических проявлений различных мутаций одного и того же гена (нейро-дегенеративное заболевание - болезнь Кеннеди и синдром тестикулярной феминизации возникают при разных мутациях одного и того же гена - гена адренорецепторов). До настоящего времени наиболее употребительной остается классификация ГБ в соответствии с нарушениями типа обмена веществ, если нарушаются гены, ответственные за синтез ферментов метаболизма, и в зависимости от пораженных органов (тканей), если мутации касаются структурных белков клетки.

В табл. 14.1 приведены наиболее распространенные в отечественной популяции ГБ, их тип наследования, наиболее характерные клинические симптомы, используемые биохимические методы диагностики. Следует отметить, однако, что после картирования генов и идентификации их мутаций для многих приведенных заболеваний уже разработаны более точные и универсальные методы ДНК-диагностики. При составлении таблицы использованы следующие руководства и монографии [1, 7, 12, 13].

Молекулярные основы диагностики ГБ

Как уже указывалось, классификация ГБ по клиническим параметрам несовершенна и пока далеко не полностью совпадает с данными молекулярной генетики о первичной структуре генов, их мутациях и фенотипической экспрессии. Дело в том, что многие ГБ носят синдромальный характер, и зачастую не удается выявить группу ведущих клинических симптомов; многие ГБ отличаются высоким уровнем фенотипической гетерогенности, связанной со спецификой мутаций, либо различиями в окружающих условиях и/или в генетическом фоне; многие ГБ, связанные с мутациями разных генов, но затрагивающие один и тот же метаболический путь, могут давать один и тот же клинический фенотип и, основываясь только на клинических симптомах, трудно провести дифференциальную диагностику. Поэтому наиболее объективная классификация ГБ с известным первичным биохимическим эффектом проводится на основе классификации соответствующих гено-продуктов с учетом их участия в определенных метаболических циклах. В качестве примера в табл. 14.2 приведена классификация основных лизосомных болезней и болезней накопления [6].

Как следует из таблицы, для 29 из 31 лизосомных болезней определена хромосомная локализация соответствующих генов, 23 из которых уже клонированы (выделены в чистом виде). Для 20 лизосомных заболеваний описаны различные мутантные аллели, что подтверждает правильность идентификации соответствующих генов. Для 12 найдены мажорные мутации в различных "популяциях.

В табл. 14.3 [показать] приведена краткая молекулярно-генетическая характеристика генов нового класса ГБ - болезней экспансии, вызываемых ранее неизвестным типом "динамических" мутаций. В основе последних, как оказалось, лежит прогрессивное (динамическое) увеличение числа внутригенных повторов трех нуклеотидов (триплетов) GАG или GGG. Накопление таких повторов ведет к нарушению функции генов (синдром ломкой Х-хромосомы, отчасти синдром миотонической дистрофии) или к появлению необычного белкового продукта с длинной полиглутаминовой цепочкой, токсичного для определенного типа нервных клеток мозга (все - нейродегенеративные заболевания). Диагностика заболевании и состояний премутации (т.е. выявление бессимптомных трансмиттеров) проводится путем определения длины триплетных повторов в соответствующих мутантных генах с помощью стандартных методов ДНК-анализа - блот-гибридизации по Саузерну (при наличии длинных повторов) либо полимеразной цепной реакции при умеренном длине повторов.

ГБ, диагностируемые молекулярными методами в России

Сводка, представленная в табл. 14.4. [показать] составлена на основании анализа работ основных отечественных лабораторий и публикаций, связанных с длиной проблемой до 2000 г. В последние годы репертуар отечественных лабораторий пополнился такими нозологиями как агаммаглобулинемия и синдром Альпорта (РЦМГ). Основные молекулярные оногенетические характеристики некоторых наиболее частых социально-значимых ГБ, ДНК-диагностика которых разработана н внедрена в практику в лаборатории авторов, приведены в табл. 14.5 [показать] . Подробно с особенностями молекулярной диагностики этих ГБ, исследованием гетерозиготного носительства, профилактики и попытками лечения методами генном терапии можно ознакомиться в монографии В.Н.Горбуновой и В.С.Баранова [6].

Основные принципы ДНК-диагностики ГБ

Методы молекулярной диагностики - продукт и основной инструмент анализа генома (наследственного аппарата), расшифровка тонкой структуры которого - безусловно эпохальное событие XX века. Согласно прогнозам Международной научной программы "Геном человека" полная расшифровка первичной структуры генома человека и соответственно идентификация всех его генов будут завершены к 2006 году. Подробно с самой программой, методами анализа генома и идентификацией мутаций можно ознакомиться в соответствующих обзорах и монографиях [2, 6, 19].

Краткая характеристика методов ДНК-диагностики

Методическую основу методов ДНК-диагностики, направленных на идентификацию мутаций или молекулярное маркирование мутантных хромосом, составляет полимеразная цепная реакция синтеза ДНК. Исторически более ранний метод блот-гибридизации по Саузерну в значительной мере утратил свои приоритеты, хотя и используется до настоящего времени для идентификации некоторых мутаций, прежде всего "динамических мутаций", ведущих к болезням экспансии (синдром фрагильной Х-хромосомы, миопическая дистрофия, хорея Гентингтона, ряд нейроддегенеративных заболеваний), а также гемофилии А и некоторых других заболеваний.

• Блот-гибридизация по Саузерну [показать]

  Метод предложен Эдвардом Саузерном (Великобритания) в 1975 г. Суть метода заключается в том, что геномная ДНК подвергается рестрикции одной или несколькими рестриктазами, после чего образующиеся фрагменты разделяются по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном геле. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно - нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам перенос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченным ДНК- или РНК-зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме.

  Блот-гибридизация - высоко чувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. При достаточно длительной экспозиции (в течение несколько дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК-зонда (более 109 расп./(мин. мкг)) метод позволяет выявлять менее чем 0,1 пг ДНК. Так, при использовании зонда размерами в несколько сотен оснований уникальная последовательность в 1000 п. о. может быть выявлена в 10 мкг геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на радиоавтографе после его экспозиции в течение 12 часов.

  Необходимость работы с чистыми препаратами ДНК, применение высокомеченных радиоактивных зондов или специальных наборов для нерадиоактивного мечения и трудоемкость всей процедуры делают ее весьма дорогостоящей. В последнее время для этих целей нередко используют различные варианты нерадиоактивного мечения или окраску ДНК нитратом серебра.

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) [показать]

  Метод ПЦР предложен в 1983 г. американским исследователем Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г.

  Метод ПЦР, или специфической амплификации ДНК, позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигонуклеотидными последовательностями ДНК, длиной обычно от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК соответственно (рис. 14.7). Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул.

  

  Для проведения специфической амплификации не требуется больших количеств матричной ДНК и в принципе достаточно даже одной молекулы. Успех в разработке метода ПЦР в значительной мере связан с использованием в качестве фермента, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур.

  Как показано на схеме, на первом этапе ПЦР исследуемая двух-нитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры, превышающей 95-98°С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно проста и заключается в чередовании циклов:

  • гибридизации, или отжига ДНК с праймерами;
  • синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК;
  • денатурации образовавшихся двухнитевых структур.

  При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до 30-50°С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам. При температуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы, 60-70°С, начинается синтез ДНК в направлении 5'-3' с двухнитевого участка, образованного праймерами. Затем при нагревании раствора примерно до 80-90°С синтез прекращается и двухнитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК расплавляется (денатурирует).

  В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем (в последующих циклах) и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифицированного участка, что и определяет в конечном счете размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.

  Таким образом, при каждом цикле происходит двукратное увеличение числа синтезированных копий выбранного для амплификации участка ДНК, и содержание продуктов амплификации в растворе нарастает в геометрической прогрессии.

  Каждая из процедур цикла определяется двумя параметрами - температурой реакции и ее длительностью, меняющейся в диапазоне от десятков секунд до 1-3 минут, так что полный цикл длится от одной до несколько минут. За 25-30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов.

  ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы - термоциклеры или амплификаторы ДНК. Такой, прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопраймеры, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNТР) и термофильную ДНК-полимеразу добавляют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают небольшой объем вазелинового масла для предотвращения высыхания, затем помещают пробирку с реакционной смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую программу циклической смены температуры и длительности каждого шага реакции. Общий объем реакционной смеси обычно составляет от 10 до 50-100 мкл. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка. Следует подчеркнуть, что реально для каждой полимеразной реакции в зависимости от типа праймеров, длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первичной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой термофильной ДНК-полимеразы, оптимальные режимы температуры и состав амплификацяонной смеси могут существенно варьировать и зачастую подбираются эмпирически.

  С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особенностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на основании анализа нуклеотидной последовательности амплифицируемого участка. Разработаны различные варианты автоматического поиска последовательностей ДНК, использование которых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации специфического участка геномной ДНК.

  Для того чтобы гибридизация проходила строго специфично, праймеры не должны содержать повторяющихся последовательностей ДНК. В качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищенной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, культуры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие неприкрепившиеся и не давшие роста клетки, соскобы с цитогенетических препаратов и, что особенно удивительно, полученные при патологоанатомическом анализе и длительно хранившиеся фиксированные ткани.

  Существуют различные модификации ПЦР, применение которых зависит от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплификатов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матричная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два этапа, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации продукты ПЦР, синтезированные на первом этапе. Часто в этих случаях для повышения специфичности праймирования используют систему так называемых вмонтированных (nested) праймеров, то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают последовательности, локализованные внутри амплифицированного на первом этапе участка ДНК.

  В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР, то есть одновременную амплификацию нескольких участков матричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые dNТР. Реакцию амплификации можно проводить не только в растворах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементарные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase reaction in ciru).

  До настоящего времени доступными амплификации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 тыс. п.о. В последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усовершенствований (особый подбор праймеров, использование сразу двух различных ДНК-полимераз, трицинового буфера, специального температурного режима полимеразных циклов), возможно проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 тыс. п. о.

  Возможность очень точного и специфичного выбора участка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых молекул, их огромное количество чрезвычайно облегчают молекулярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ультрафиолетовом свете в виде красной полосы после электрофорeтического концентрирования и обычного окрашивания геля бромидом этидия. При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза количество и положение окрашенных полос на геле изменяется в соответствии с положением этих сайтов. С помощью электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет делений или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной матричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также структурные изменения в дуплексах между нормальными и мутантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И наконец, возможно определение полной нуклеотидной последовательности синтезированных молекул с идентификацией всех мутаций в исследуемом районе матричной ДНК. Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преимущественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последующем значительно облегчает их секвенирование.

  Таким образом, метод ПЦР стал одним из основных в молекулярной диагностике наследственных болезней.

  Разработаны и широко используются в практике различные варианты данного метода, позволяющие быстро и эффективно идентифицировать мутации, изучать ДНК-полиморфизмы, применяемые для молекулярного маркирования мутантных хромосом. Методы идентификации уже известных мутаций в исследуемом гене, основанные на принципе ПЦР, включают:

  • метод аллель-специфических олигонуклеотидов (АS0);
  • метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза;
  • метод амплификации рефрактерной мутационной системы (АRМS);
  • метод гетеро-дуплексного анализа.

  Первичную идентификацию мутаций также проводят с использованием вариантов ПЦР. Это метод анализа конформацнонного полиморфизма однонитевой ДНК (SSСР); метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGЕ), метод химического расщепления некомплементарных сайтов (СМС). Подробно с этими и другими модификациямн и специальными вариантами ПЦР можно ознакомиться в специальной литературе [6].

Прямая и косвенная ДНК-диагностика

Решающим преимуществом методов ДНК-диагностики является их универсальность, т.е. они могут быть использованы практически на любой стадии развития организма и практически на любых тканях. В диагностике генных болезней существуют два основных подхода - прямая диагностика, основанная на непосредственной идентификации мутации в определенном гене и непрямая (косвенная) диагностика, в основе которой лежит маркирование мутантмого гена (иногда называемая маркированием хромосомы, несущей мутантный ген) с помощью молекулярных маркеров. Рассмотрим кратко эти подходы.

Твердо установлено, что в основе любого моногенного заболевания лежат нарушения функции гена, вызванные различными мутациями в его смысловой части, т.е. в последовательности гена, кодирующей синтез белка (кДНК). Тип и спектры мутаций, равно как и их фенотипическое выражение (тяжесть заболевания) специфичны для каждого гена и в значительной степени определяются уникальными особенностями его первичной структуры (последовательностью нуклеотидов). Известно также, что частота различных мутаций в каждом гене различна. Существуют так называемые мажорные мутации, частота которых особенно высока, представляющие особенно большую диагностическую ценность, и минорные, или спорадические, единичные мутации, встречающиеся крайне редко.

Для многих генов, ответственных за наследственные заболевания, спектры мутаций уже хорошо изучены и разработан оптимальный алгоритм их идентификации. Так, мажорной для гена муковисцидоза является мутация del F508, встречающаяся почти в 50% всех мутантных хромосом у больных муковисцидозом России, для гена фенилаланингидроксилазы - это мутация R408W, обнаруженная у 45% больных феннлкетонурией России, для гена дистрофина характерными являются достаточно протяженные делеции, регистрируемые в 60% Х-хромосом у больных миодистрофией Дюшенна и т. д.

Основу прямой диагностики доставляет идентификация мутаций в самом гене.

Преимущества метода: 1) высокая (приближающаяся к 100%) точность диагностики; 2) возможность анализа информативности (пригодности для молекулярной диагностики)семьи и выявление гетерозиготных носителей при отсутствии больного ребенка.

Недостаток метода - отсутствие сведений о мажорных мутациях гена, требующее зачастую достаточно детального молекулярного сканирования его первичной структуры с целью обнаружения мутаций. Алгоритмы молекулярной диагностики различных моногенных болезней приведены выше и в монографии [6].

Непрямой (косвенный) подход в молекулярной диагностике является исторически более ранним и более универсальным. Его концептуальную основу составляет маркирование мутантного гена (хромосомы) при помощи молекулярных маркеров. В качестве последних обычно выступают полиморфные сайты, т.е. короткие ДНК-последовательности одних и тех же участков гомологичных хромосом, отличающиеся по своей первичной структуре. Эти диагностические полиморфные сайты могут располагаться либо внутри самого гена, либо находиться в непосредственной близости от него. В самом простом варианте - это замена единичного нуклеотида, делающая данный фрагмент ДНК устойчивым или, наоборот, чувствительным к определенной рестриктазе (эндонуклеазе) - ферменту микробного происхождения, узнающему определенную последовательность из четырех и более нуклеотидов и разрезающему (рестрицирующему) молекулу ДНК [6].

Наличие или отсутствие сайта рестрикции в тождественных локусах гомологичных хромосом позволяет достаточно надежно маркировать мутантный и нормальный ген и проследить его передачу потомству.

Другой тип ДНК-полиморфизма представлен короткими тандемными дн-, три-, тетра- и более повторами также расположенными внутри или рядом с геном, длина которых варьирует на разных гомологичных хромосомах.

Итак, в первом варианте тождественные гены (гомологичные хромосомы) будут отличаться друг от друга по наличию или отсутствию сайтов рестрикции, в другом - по длине "кOровых" повторов. И в одном, и в другом случае мутантные и нормальные аллели маркируются этими полиморфизмами.

Важно, однако, чтобы гомологичные локусы у одного и того же индивидуума несли разные молекулярные маркеры, т.е. чтобы индивид был гетерозиготен по анализируемому маркеру. Именно гетерозиготность по молекулярным полиморфизмам определяет информативность той или иной семьи высокого риска рождения ребенка с генной патологией.

Сайтовые замены, т.е. полиморфизм 1-го типа, характеризуются, как правило, низкой гетерозиготностыо, не превышающей 50%. Информативность количественных полиморфизмов (тип II) обычно существенно выше и может достигать 80-90% и более.

В зависимости от распределения маркерных аллелей на гомологичных хромосомах больного и его родителей семья может быть полностью информативной для ДНК-диагностики, частично информативной или неинформативной (рис. 13.8).

Используя косвенный метод, принципиально важно проанализировать в семье высокого риска такое количество полиморфных сайтов одного гена, чтобы точно определить, с каким конкретным аллелем наследуется мутантный ген, и сделать семью полностью информативной для последующей пренаталыюй диагностики.

Технически для проведения диагностики с помощью данного метода вначале амплифицируют с помощью ПЦР фрагмент ДНК, несущий полиморфный сайт; продукт амплификации либо сразу подвергают электрофорезу для детекции полиморфизма второго типа, либо предварительно рестрицируют с помощью соответствующей эндонуклеазы для выявления наличия (отсутствия) полиморфного сайта рестрикции, и продукты рестрикции анализируют после электрофореза.

Решающее преимущество косвенного метода - возможность ДНК-диагностики без точной идентификации мутаций в самом гене и даже при отсутствии данных о точной идентификации и клонировании самого мутантного гена. Его существенными недостатками являются невозможность диагностики при отсутствии больного ребенка (нельзя точно определить, с каким полиморфным аллелем сцеплен мутантный ген), вероятность ошибки диагноза в связи с возможностью кроссинговера в мейозе и переноса полиморфного сайта на здоровый аллель.

Точность молекулярной диагностики, возможные источники ошибок

Прямая ДНК-диагностика путем идентификации мутаций в самом гене позволяет получить практически абсолютный ответ о наличии пли отсутствии конкретной мутации, методика идентификации которой хорошо разработана. Вместе с тем сложность и высокая чувствительность самих методик, их многоэтапность, необходимость контроля чистоты выделенной ДНК и качества ферментов рестрикции могут служить источником технических ошибок диагностики.

К этому надо добавить, что существует крайне малая вероятность непредсказуемых спонтанных мутаций в уже мутантном аллеле, нечеткость границ длины триплетных повторов в случае "динамических" мутаций при болезнях экспансии. Эти обстоятельства всегда следует учитывать при медико-генетическом консультировании семьи высокого риска после ДНК-диагностики.

Значительно сложнее оценка результатов ДНК-диагностики косвенным методом. В случае учета внутригенных полиморфизмов точность непрямой диагностики достаточно высока, т. к. величина внутригенного кроссинговера, как правило, не превышает 0,1% для большинства известных генов. Исключение могут составлять только такие сравнительно крупные гены, как гены дистрофина, гемофилии А, нейрофиброматоза и некоторые другие. Так, в случае гена дистрофина ошибка диагноза может достигать 2%, что соответствует высокой частоте внутригенного кроссинговера (около 2%) в этом гигантском гене (2,2 млн п. о.). Важно также учитывать степень родства больного и пробанда, у которого проводится ДНК-диагностика. Величина возможной ошибки возрастает, если маркерный аллель определяется не у сибса пробанда, а у других его родственников.

Особенно осторожно следует оценивать результаты непрямой диагностики с использованием внегенных полиморфных локусов. Считается, что с уверенностью проводить ПД в этих случаях можно только при одновременном тестировании нескольких полиморфных сайтов, фланкирующих мутантный ген. Обычно для молекулярной диагностики используют маркеры, частота рекомбинаций которых с мутантпыми аллелями гена не превышает десятых и даже сотых долей процента. Более детальная информация о молекулярной диагностике наиболее частых, социально значимых ГБ приведена в монографии [6].

ЛИТЕРАТУРА [показать] .

Источник: Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001