Страница 1 2 3

всего страниц: 3

Спектр показаний для пренатальной диагностики (ПД) варьирует в зависимости от диагностических возможностей и специализации Центров или лабораторий ПД, однако при этом важно учитывать, что основная доля пренатальных исследований (до 90%) приходится на цитогенетические анализы. Это связано с большим удельным весом беременных с риском рождения ребенка с хромосомной патологией. Помимо этого, согласно опыту нашего Центра [5, 13], кариотипирование целесообразно во всех случаях наличия плодного материала независимо от основной причины инвазпвного вмешательства (моногенные болезни, резус-конфликт и пр.).

Основные принципы цитогенетического анализа

В настоящее время проблема цитогенетической диагностики почти на любом сроке беременности практически решена. Разработаны надежные и эффективные методы хромосомного анализа клеток плода и зародышевых оболочек. В зависимости от срока беременности и задач исследования материалом для хромосомного анализа могут быть клетки амниотичeской жидкости, хориона, плаценты и лимфоцитов пуповинной крови плода, полученные тем или иным инвазивным способом. В нашем Центре наиболее часто используются клетки хориона (1-й триместр) или клетки плаценты (2-3-й триместры), полученные с помощью трансабдоминальной хорионбиопсии или плацентоцентеза (рис. 13.5). Хромосомные препараты из тканей хориона/плаценты готовят прямым или непрямым методами, детально рассмотренными ранее в Методических рекомендациях (рис. 13.7) [6]. Преимущества и недостатки цитогенетического анализа при использовании разных методов получения хромосомных препаратов из плодного материала представлены в табл. 13.10 [показать] ).

Использование в большинстве Центров комплекса цитогенетических и молекулярно-цитогенетических методов диагностики позволяет получить наиболее полную информацию о кариотипе плода на различных стадиях внутриутробного развития.

Особенности цитогенетического анализа клеток различного плодного происхождения

Клетки амниотической жидкости

Клетки амниотической жидкости (КАЖ) представлены несколькими типами различного происхождения:

• собственно амниоциты, т.е. слущенные клетки амниотической оболочки плода,
• эпителиальные клетки и фибробласты кожи, кишечника и ротовой полости плода.

Большая часть из них нежизнеспособна, остальные могут пролиферировать путем митотического деления и образовывать колонии в культуральных условиях.

Существует два основных метода культивирования КАЖ различающихся по способу получения колоний и методам фиксации:

1. Flask-метод - культивирование клеток во флаконах и фиксация суспензии монослойной культуры после трипсинизации. Анализ проводят в двух из трех культур (по 10 метафаз для каждого образца). Если во всех метафазах наблюдается одинаковый кариотип, диагноз считается установленным. В случае обнаружения единичной метафазы с аберрантным кариотипом (числовым или структурным), анализируется резервная третья культура. Если одна и та же хромосомная аберрация определяется в более чем одной метафазе из одного флакона, но не подтверждается в остальных флаконах, устанавливается диагноз "псевдомозаицизм". В случае обнаружения одной и той же хромосомной аномалии в более чем одном флаконе, устанавливается диагноз "истинный мозаицизм".
2. Метод in situ - культивирование и фиксация клеток на покровных стеклах в чашках Петри или в специальных флаконах-слайдах. Анализ проводят по метафазным пластинкам из трех культуральных чашек (всего анализируют 10 колоний). При выявлении аномального клона анализируют все культуры. Хромосомная аберрация, наблюдаемая лишь в одной чашке, свидетельствует о "псевдомозаицизме", более чем одной в - об истинном мозаицизме.

Клетки ворсин хориона (плаценты): "прямой" метод и длительное культивирование

Клетки ворсинчатого хориона (плаценты), доступные для цитогенетического анализа, имеют различное происхождение:

• клетки цитотрофобласта, дифференциация которого происходит на стадии зародышевого пузырька (бластоцисты);
• клетки мезенхимы, дифференцирующиеся во внутриклеточной массе зародыша на стадии бластоцисты.

Для хромосомного анализа по клеткам хориона или плаценты используют два основных метода:

1. "Прямой", основанный на анализе спонтанных митозов клеток цитотрофобласта. Известны многочисленные модификации метода, предложенного впервые в 1983 г. Брамбати и Симони [30], главными из которых являются два:
   • непосредственная фиксация клеток и
   • фиксация после кратковременной (24-48 ч) инкубации ворсин в культуральной среде с питательными добавками.

   Анализируют по 11-20 метафазных пластинок.

2. Длительное культивирование в монослойной культуре, основанное на анализе клеток мезенхимы. Основные принципы анализа и интерпретации результатов аналогичны описанным выше для культур КАЖ.

Диагностические проблемы, обусловленные анализом клеток хориона (плаценты), обсуждены в следующем разделе.

Лимфоциты крови плода

Для хромосомного анализа крови плода используют стандартную методику стимулирования лимфоцитов фитогемагглютинином (ФГА). Анализируют обычно 11-20 метафазных пластинок.

Этот метод дает наиболее адекватное представление о хромосомном статусе плода и настоятельно рекомендуется для кариотипирования плода в случае хромосомного мозаицизма в плаценте, а также при наличии пороков развития не только во 2-м, но, как показывает наш опыт,- и в 3-м триместре беременности. В последнем случае кариотипирование плода позволяет разрешить вопрос о тактике ведения беременности, родов и неонатального периода.

Диагностические проблемы кариотипирования плода

Основными проблемами цитогенетической пренатальной диагностики являются:

• контаминация материнскими клетками;
• "псевдомозаицизм" в КАЖ;
• мозаицизм, ограниченный плацентой, в ворсинах хориона (плаценты);
• структурные перестройки хромосом, возникшие de novo;
• неидентифицируемые маркерные хромосомы.

Контаминация материнскими клетками

Образцы эмбрионального материала могут быть контаминированы клетками материнского происхождения. При длительном культивировании материнские клетки могут пролиферировать и приводить к диагностическим ошибкам. Риск ошибок, обусловленных контаминацией, составляет 0,16% при культивировании КАЖ и выше (до 0,4%) при культивировании клеток ворсин хориона [24, 33]. Избежать контаминации возможно лишь при сокращении времени культивирования или при использовании "прямого" метода приготовления препаратов.

"Псевдомозаицизм" в КАЖ

Различают три типа "псевдомозаицизма":

• ограниченный одним участком колонии;
• затрагивающий все метафазные пластинки одной колонии;
• затрагивающий несколько колоний в пределах одной чашки.

При flask-методе под "псевдомозаицизмом" понимают наличие многочисленных клеток с однотипной хромосомной аномалией в пределах одного флакона. Частота "псевдомозаицизма", по суммарным данным различных лабораторий варьирует в пределах 0,6-1,0% [28].

Мозаицизм, ограниченный плацентой

Несоответствие (дискордантность) хромосомного набора в клетках зародышевых оболочек (хориона, амниона) и собственно эмбриона человека впервые описано Калушек [23]. Авторы предположили, что на каждой стадии раннего эмбрионального развития возможно нерасхождение хромосом в любом митотическом делении, что может приводить к мозаичным кариотипам в клетках плаценты или плода, но не обязательно эти события совпадают. Серьезные проблемы возникают при обнаружении хромосомной аномалии (в мозаичной или полной форме) в "прямых" препаратах из ворсин хориона, которая не подтверждается при исследовании тканей абортированного плода. Ограниченный плацентой мозаицизм является источником диагностических ошибок в 1-2% исследований, основанных только на клетках ворсинчатого хориона.

Классификация типов хромосомного мозаицизма в зависимости от его генеза [29] приведена в табл. 13.11 [показать] ).

Наиболее частым является мозаицизм типа 1. При этом типе практически не описано влияние на внутриутробное развитие плода. При типе 2 в некоторых случаях наблюдается синдром задержки развития плода. Наиболее редкий - тип 3, при котором беременность осложняется задержкой развития плода и/или его смертью.

Структурные перестройки хромосом, возникшие de novo

При обнаружении у плода, родители которого кариотипически нормальны, кариотипа со структурными перестройками хромосом возникает дилемма, поскольку невозможно полностью исключить микроперестройки, и, следовательно, несбалансированность хромосомного набора у плода. Такие случаи достаточно редки и встречаются с частотой 0,06-0,20% от всех пренатальных исследований. В первую очередь в такой ситуации необходимо подтвердить отцовство. Риск рождения ребенка с какими-либо аномалиями развития при кариотипе с истинными структурными перестройками, возникшими de novo, оценивается в 10% [28].

Маркерные хромосомы

При обнаружении в кариотипе плода маркерной хромосомы рекомендовано исследование кариотипа родителей для установления происхождения маркера и типа мозаицизма (полный или частичный).

Риск рождения ребенка с аномалиями развития различен в зависимости от того, унаследована ли маркерная хромосома от одного из родителей или она возникла de novo. В том случае, когда один из фенотипически нормальных родителей является носителем идентичной маркерной хромосомы, прогноз в отношении плода более благоприятен.

Для несемейных маркерных хромосом общий риск аномалий у плода составляет около 8% для сателлитных маркеров (содержащих короткие плечи акроцентрических хромосом, несущих рибосомные гены) и 27% - для несателлитных [28].

Если при идентификации маркерной хромосомы различными методами дифференциального окрашивания (G-, Q-, NOR-, DА/DАРI, FISH) выявлен эухроматиновый материал, это свидетельствует о частичной трисомии, что с большой вероятностью приведет к аномалиям у плода.

Особенно ценной является возможность точной идентификации природы маркерной хромосомы методом гибридизации in situ (FISH) с использованием наборов цельнохромосомных ДНК-проб [6, 13].

Страница 1 2 3

всего страниц: 3

ЛИТЕРАТУРА [показать] .

Источник: Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001