kub
Островок  здоровья

----
  
записная книжка врача акушера-гинеколога Маркун Татьяны Андреевны
----
 
 
 

Хламидиоз
Методические рекомендации

Хламидиоз
Составители:

Чл.-корр. РАМН, проф. Серов В. Н.,
чл.-корр. РАМН, проф. Краснопольский В. И.,
проф. Делекторский В. В.,
проф. Афанасьев С. С.,
д.м.н. Денисов Л. А.,
к.м.н. Яшкова Г. Н.,
к.м.н. Шаповаленко С. А.,
к.м.н. Козаченко М. А.,
к.б.н. Цветаева Т. Ю.,
к.м.н. Сорокин С. В.,
к.х.н. Аваков А. Э.,
к.м.н. Жуковский Я. Г.,
к.м.н. Пауков С. В.,
к.м.н. Рубальский О. В.,
Зулькарнеев Р. Ш .,
Хасьянов Э. А.

Содержание

ДИАГНОСТИКА ХЛАМИДИОЗА

В обследовании на хламидий прежде всего нуждаются женщины (беременные и небеременные):

  • c наличием воспалительных заболеваний гениталий, особенно с поражением шейки матки: цервицит, "эрозия";
  • c бесплодием в течение 2-3-х лет;
  • беременные с отягощенным акушерским анамнезом (неразвивающаяся беременность, самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды, рождение маловесных детей (средняя масса тела доношенных детей, рожденных женщинами с хламидиозом гениталий достоверно ниже, чем детей матерей без хламидиоза) и с осложненным течением настоящей беременности (угроза прерывания, многоводие, лихорадка неясной этиологии, гипертрофия плода).

Важно подчеркнуть, что исследование на хламидий у вышеуказанных женщин надо проводить независимо от картины влагалищного мазка и от наличия сопутствующей условно-патогенной микрофлоры в половых путях, так как доказано, что генитальный хламидиоз протекает преимущественно (почти у 80% больных) при нормальной картине влагалищного мазка (то есть при I и II его типах).

При проведении гинекологического осмотра характерно наличие "эрозии" шейки матки, эндоцервицита, кольпита, обильных слизисто-гнойных выделений из влагалища; кроме того, часто выявляется гиперемия наружного отверстия мочеиспускательного канала и, нередко, остроконечные кондиломы (Черепова В. И., 1988).

Расширенная кольпоскопия позволяет предположить хламидийную инфекцию у больных с псевдоэрозиями шейки матки при обнаружении: простой типичной эктопии с признаками цервицита, имеющей четкие ровные границы; простой эктопии с признаками цервицита нередко в сочетании с лейкоплакией или основой лейкоплакии, расположенных по периферии эктопии; сосудистой атипии в виде штопоровидных капилляров (Рудакова Е. Б., и соавт., 1995).

У больных с эндоуретральными остроконечными кондиломами хламидийной этиологии при объективном исследовании выявляется следующее: губки уретры отечны, на них расположены остроконечные кондиломы в виде петушиного гребешка (могут быть одиночными и множественными). При их глубинном расположении в диагностике помогает уретроскопия и специальные лабораторные исследования.

Диагноз хламидиоза ставится на основании анамнеза, оценки клинических признаков заболевания и лабораторных методов исследования. В связи с тем, что для генитального хламидиоза более характерно малосимптомное и латентное течение, основное значение имеет лабораторная диагностика этой инфекции.

Наиболее объективными методами диагностики хламидиоза являются культуральный метод (золотой стандарт), метод гибридизации ДНК, полимеразная цепная реакция, иммуноферментный анализ, методы прямой и непрямой иммунофлюоресценции с использованием отечественных (Хламислайд, Хламискан, Хламимоноскрин) и импортных ("МicroNrek", "Syva" USA, "Сlamytest" Orion Diagnostica, Finland и др.) тест систем иммунохромотографии ("Сlearview Chlamydia" Unipath Limited, England).

Серологические методы можно рассматривать как дополнительные при обосновании диагноза.

Очень важным для диагностики хламидиоза является правильный забор материала для последующего лабораторного исследования.

Техника взятия материала

Одним из самых ответственных этапов диагностики хламидиоза является забор материала. Именно этот этап должен проводиться лечебными учреждениями широкого профиля, в то время как дальнейшая обработка материала может осуществляться в специализированных лабораториях.

При исследовании на хламидий методом культуры клеток перед взятием материала больные не должны принимать в течение месяца антибиотики тетрациклинового ряда, при цитологической методике, в том числе и при использовании моноклональных флюоресцирующих антител, эти препараты не следует применять за две недели до исследования. Перед взятием материала больные не должны мочиться в течение 1-1,5 часов. При взятии материала на хламидий следует помнить, что оптимальным для персистенции и размножения С. trachomatis являются определенные участки цилиндрического эпителия мочеполовых путей (передняя уретра на глубине 2,5-4 см у мужчин и слизистая оболочка цервикального канала матки 1,5 см у женщин).

При взятии материала из шейки матки ключевым моментом являлось удаление слизистой пробки. От тщательности проведения этой подготовительной процедуры во многом зависит возможность правильного соскоба из цервикального канала. Слизистую пробку удаляют ватным тампоном и пинцетом, а затем берут материал специальной щеточкой cervex brush или voba-brush фирмы Rovers (Голландия), имеющей ряд преимуществ, так как для получения репрезентативного результата важно присутствие в нем клеток со всей поверхности шейки матки, цервикального канала, зоны трансформации и наружной части шейки матки.

Забор материала у девочек производится со слизистой оболочки преддверия влагалища, в отдельных случаях - из заднего свода влагалища, путем введения зонда через гименальные кольца (как при вагиноскопии).

Взятый соскобный материал (за исключением случая применения метода культуры клеток) помещают на предметное стекло, равномерно распределяют тонким слоем и высушивают на воздухе. Фиксация материала осуществляется безводным ацетоном, метанолом или этанолом посредством нанесения их на препарат в количестве 2-3 капель или путем погружения препарата в раствор фиксатора на 30 секунд. Хранить и транспортировать препараты рекомендуется при комнатной температуре. Обрабатывать следует в течение 7 дней.

Диагностика хламидии на культуре клеток МсСоу

Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким, является метод диагностики хламидийной инфекции посредством изоляции возбудителя на культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами (Золотой стандарт). Для этой цели обычно используют культуру клеток МсСоу, обработанных циклогексемидом.

Приготовление питательных сред:

  1. Ростовая среда: среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин - 5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 4% от общего объема, гентамицин - 40 мкг/мл.
  2. Изолирующая среда (среда с антибиотиками для заражения клеток клиническим материалом): среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин -5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 8% от общего объема, гентамицин - 40 мкг/ мл, 10% глюкоза - 5 мл.
  3. Транспортная среда (для забора и хранения клинического материала): фосфатный буфер с сахарозой (сахароза 48,46 г., К2НР04 (б/в) - 2,088 г., КН2Р04 (б/в) - 1,088 г. на 1 л дистиллированной воды, довести рН до 7,0). Разлить по аликвотам и автоклавировать при 115° C 15 мин.

Хранить при 4° C до применения 1-2 мес.

Перед использованием к буферному раствору добавляют инактивированную нагреванием сыворотку крупного рогатого скота - 4% от общего объема, стрептомицин - 50 мкг/мл, амфотерицин В - 25 мкг/мл среды.

В качестве транспортной среды можно также использовать ростовую среду, к 100 мл которой вносят 1 мл 5% глюкозы, и вышеуказанные антибиотики в соответствующей концентрации.

Транспортную среду стерильно разливают по 2 мл в пенициллиновые флаконы с бусинками и хранят при 20° C в течение месяца.

Инокуляция клинического материала:

Готовят раствор циклогексимида на изолирующей среде - 2 мкг/мл. В стерильные плоскодонные пробирки с помещенными в них покровными стеклами добавляют по 2 мл клеточной суспензии (1 х 105 клеток/мл) и ставят их на 16-24 часа в термостат при 37° C.

В пенициллиновые флаконы с транспортной средой, содержащей клинический материал, при интенсивном встряхивании добавляют 2 мл свежеприготовленной изолирующей среды. В это время из пробирок с монослоем удаляют ростовую среду, не разрушая монослоя. Затем распределить изолирующую среду из пенициллиновых флаконов с инфекционным материалом приблизительно по 2 мл в две плоскодонных пробирки с монослоем и центрифугировать их в течение часа при 3000 об/мин (2400 д) в центрифуге с горизонтальным ротором. Инкубировать в термостате при 37° C - 2 часа, затем удалить изолирующую среду и добавить по 2 мл новой порции изолирующей среды с циклогексимидом (2 мкг на мл). Материал инкубируется в термостате при 37° C 48-72 часа.

Фиксация и окраска:

Удалить среду из пробирок, не нарушая монослоя, добавить 1-2 мл метанола, осторожно по стенке, фиксировать в течение 10 мин осторожно потряхивая пробирку для ресуспензирования белкового осадка. Промыть фосфатным буфером (рН 6,8). Приготовить краску по Романовскому-Гимза на фосфатном буфере 1:10 (1 часть краски и 9 частей фосфатного буфера). Прилить по 1 мл краски в каждую пробирку, через 30-60 мин удалить ее и дифференцировать препарат 30% метанолом на фосфатном буфере. Стекла высушить. Монтировать на предметное стекло покровные стекла монослоем вниз в канадском бальзаме.

Просматривать в темнопольном микроскопе на присутствие включений при увеличении в 400 или 600 раз. В темном поле включения хламидии дают желто-зеленую флюоресценцию. В сомнительных случаях рекомендуется исследовать в световом микроскопе под иммерсией с объективом х 90. ' Элементарные тельца хламидии имеют розовый, а ретикулярные - синий цвет.

Диагностика хламидии методом гибридизации ДНК

Для определения ДНК хламидии часто используют весьма информативный метод точечной гибридизации (дот-гибридизации) нуклеиновых кислот на твердой фазе с использованием ДНК-зонда, меченого биотином. Из исследуемых образцов выделяют суммарную ДНК. Образцы исследуемой ДНК и контрольные образцы денатурируют кипячением, фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и гибридизуют с предварительно денатурированным биотинированным ДНК-зондом. Не связавшийся зонд удаляют путем отмывки фильтра. На следующем этапе фильтр обрабатывают коньюгатом страптавидина с щелочной фосфатазой. На заключительном этапе вносят субстратный раствор. Окрашивание соответствующих точек свидетельствует о наличии тестируемой ДНК в исследуемом материале.

Рабочие растворы готовят согласно инструкции предприятия изготовителя тест-системы. Гинекологические мазки переводят в физиологический раствор и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин., надосадочную жидкость сливают, а оставшуюся суспензию клеток хранят в замороженном виде до проведения анализа.

Проведение анализа:

В чашку Петри с 10-15 мл дистиллированной воды помещают нитроцеллюлозный фильтр на 5-10 мин до полного смачивания. Мокрый фильтр переносят в другую чашку с 4 мл раствора 10 х SSC, выдерживают 10 минут и подсушивают на воздухе на фильтровальной бумаге.

100 мкл суспензии клеток анализируемого материала смешивают с равным объемом лизирующего раствора, тщательно перемешивают и выдерживают 3 часа при 37-40° C и 5 мин при 60° C. Затем добавляют 0,05 мл ацетата калия, перемешивают и выдерживают 30 мин при 0 - 4° C, после чего центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок перемешивают на воздухе и растворяют в 10 мкл раствора 10 x SSC. Подготовленные пробы, положительный и отрицательный контроли денатурируют на кипящей водяной бане в течение 10 мин, затем быстро переносят пробирки в баню лед-вода на 5 мин и наносят на подготовленный фильтр по 2 мкл в пятно. Фильтр высушивают на воздухе и запекают при 80° C в течение 2 часов.

Далее фильтр с пробами смачивают в дистиллированной воде, переносят в чашку Петри и заливают сверху 10 мл блокирующего раствора. Фильтр инкубируют 1 час при комнатной температуре на качалке, затем блокирующий раствор сливают и фильтр заливают 5 мл гибридизационного раствора. При этом необходимо тщательно закрыть чашку Петри для избежания испарения гибридизационного раствора. Гибридизацию проводят при 42° C в течение 12-15 ч в термостате.

Фильтр отмывают от несвязавшегося зонда путем трехкратной инкубации при комнатной температуре по 10 мин в промывочном растворе. Далее фильтр инкубируют 15 мин в водяной бане при температуре 60° C в промывочном растворе и один раз в течение 5 мин при комнатной температуре в растворе ТSТ. Для блокирования неспецифического связывания коньюгата фильтр заливают 10 мл раствора для блокирования и выдерживают 0,5 ч при комнатной температуре на шейкере. Далее фильтр ополаскивают раствором ТSТ и выдерживают в 6 мл рабочего раствора коньюгата в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем фильтр 3 раза по 10 мин промывают в растворе ТSТ и один раз в растворе для приготовления проявляющей смеси. Фильтр заливают 5 мл проявляющей смеси с субстратом и хромогеном и выдерживают в темноте при 20° C в течение нескольких часов до появления окраски. Фильтр промывают дистиллированной водой для остановки проявления и высушивают.

Учет результатов:

Результаты гибридизации оценивают визуально путем сравнения с интенсивностью окраски пятен контрольных проб. Положительными считаются образцы, имеющие окраску пятна, отчетливо отличающуюся вследствие большей интенсивности от фоновой окраски.

Диагностика хламидий методом полимеразной цепной реакции

В настоящее время полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее распространенной и объективной методикой диагностики хламидийной инфекции.

Клинический материал для ПЦР собирают в пробирки с буферным раствором. Хранят в морозильных камерах. Повторное замораживание - оттаивание не допускается.

Обработка материала:

Клинический материал в объеме 100 мкл смешивают с 100 мкл лизирующего буфера (1% твин-20, 1% МР-40, 60 мкг/мл протеиназы К, фосфатный буфер). Смесь инкубируют при 56° C в течение 2 часов, после чего инактивируют при 95° C в течение 10 мин. Термическая обработка необходима для инактивации протеиназы К и обеззараживания клинического образца. Инактивированные образцы центрифугируют при 10000 д 10 мин. Супернатант собирают и используют для проведения ПЦР.

Проведение ПЦР:

Реагенты вносят в реакционную пробирку в следующей последовательности:

  1. вода бмдистиллированная - до 30 мкл конечного объема смеси;
  2. реакционный буфер 10х-2,5 мкл;
  3. 650 мМ раствор МgCl2 - 1,2 мкл;
  4. смесь dNTP's - 2,5 мкл;
  5. Taq полимераза - 1-1,5 ед.;
  6. олигонуклеотидные праймеры -15 пмоль;
  7. контрольный образец ДНК или клинический образец -1-2 мкл.

Для предохранения от испарения поверх реакционной смеси наслаивают, 30 мкл минерального масла. Пробирки помещают в амплификатор.

Проводят ПЦР в следующих температурных режимах:
96° C 4 мин, 55° C 10 мин - 1 цикл;
95° C 1 мин, 55° C 1 мин, 72° C 2 мин - 35 циклов;

После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют методом, электрофореза в 1,5% агарозном геле. Наличие специфического фрагмента ДНК определяют с помощью контрольной ДНК исследуемого возбудителя, амплифицированной одновременно с клиническими образцами.

Результат анализа считается положительным в следующем случае:

  • размер ДНК-продукта в клиническом образце точно соответствует ДНК-продукту, положительной контрольной пробы;
  • в пробе, содержащей клинический образец и внутренний стандарт, идентифицируют специфический ДНК-продукт внутреннего стандарта;
  • в пробе, содержащей вместо клинического образца аликвоту воды (отрицательный контроль), ДНК-продукты не обнаруживают.

Результат анализа считается отрицательным в следующем случае:

  • в пробе, содержащей клинический образец, специфических ДНК-продуктов не обнаруживают;
  • результаты ПЦР в обеих контрольных пробах - как в предыдущем случае.

Анализ следует повторить в следующих случаях:

  • в пробе, содержащей контрольную ДНК, специфический продукт не обнаруживают;
  • в пробе с внутренним стандартом специфический продукт не обнаруживают;
  • в отрицательном контроле обнаруживают специфический ДНК-продукт.

Описанные выше три методики лабораторной диагностики хламидиоза в настоящее время являются наиболее точными и информативными.

Мы не будем в настоящей работе описывать промышленные тест-системы, основанные на прямой и непрямой иммунофлюоресценции, ибо каждая из них содержит соответствующую инструкцию. Стоит лишь сказать, что все они имеют несколько меньшую точность, но существенно выигрывают в простоте постановки диагноза.

Исключить артефакты, возникающие при диагностике хламидиоза люминесцентными методами, позволяет дополнительный тест, предложенный профессором В. В. Делекторским. Тест основан на том, что элементарное тельце хламидий (инфекционная единица) представляет собой кристаллоид, что является следствием макромолекулярной упаковки ДНК. Перефокусировка люминесцентного микроскопа приводит к возникновению по периферии элементарного тельца четкого дифракционного кольца (кольца Френеля).

Другие микроорганизмы, а также ретикулярное тельце хламидий, дифракционное кольцо не образуют. Достоверность метода не требует находки 10 элементарных телец в микроскопе. Диагноз считается положительным, если в препарате обнаруживают 2-3 элементарных тельца, образующих при фокусировке дифракционные кольца. Наличие дифракционного кольца у исследуемых структур является дополнительным диагностическим тестом, позволяющим исключить ошибки.

Следует особенно отметить, что при наличии смешанного процесса, в частности гонорейно - хламидийного, диагностика хламидиоза иммунофлюоресцентными методами затруднена. Это связано с тем, что при гонорее за счет большого количества лейкоцитов слизистые покрыты слоем белка, следствием чего является большое количество ложноотрицательных результатов. Инкубационный период при гонорейной и хламидийной инфекции различен, поэтому при одновременном инфицировании этими двумя микроорганизмами, хламидии могут выявляться значительно позже.

Лечение хламидиоза и критерий излеченности при хламидиозе


 
 

Куда пойти учиться



 

Виртуальные консультации

На нашем форуме вы можете задать вопросы о проблемах своего здоровья, получить поддержку и бесплатную профессиональную рекомендацию специалиста, найти новых знакомых и поговорить на волнующие вас темы. Это позволит вам сделать собственный выбор на основании полученных фактов.

Медицинский форум КОМПАС ЗДОРОВЬЯ

Обратите внимание! Диагностика и лечение виртуально не проводятся! Обсуждаются только возможные пути сохранения вашего здоровья.

Подробнее см. Правила форума  

Последние сообщения



Реальные консультации


Реальный консультативный прием ограничен.

Ранее обращавшиеся пациенты могут найти меня по известным им реквизитам.

Заметки на полях


навязывание услуг компании Билайн, воровство компании Билайн

Нажми на картинку -
узнай подробности!

Новости сайта

Ссылки на внешние страницы

20.05.12

Уважаемые пользователи!

Просьба сообщать о неработающих ссылках на внешние страницы, включая ссылки, не выводящие прямо на нужный материал, запрашивающие оплату, требующие личные данные и т.д. Для оперативности вы можете сделать это через форму отзыва, размещенную на каждой странице.
Ссылки будут заменены на рабочие или удалены.

Тема от 05.09.08 актуальна!

Остался неоцифрованным 3-й том МКБ. Желающие оказать помощь могут заявить об этом на нашем форуме

05.09.08
В настоящее время на сайте готовится полная HTML-версия МКБ-10 - Международной классификации болезней, 10-я редакция.

Желающие принять участие могут заявить об этом на нашем форуме

25.04.08
Уведомления об изменениях на сайте можно получить через раздел форума "Компас здоровья" - Библиотека сайта "Островок здоровья"

Островок здоровья

 
----
Чтобы сообщить об ошибке на данной странице, выделите текст мышью и нажмите Ctrl+Enter.
Выделенный текст будет отправлен редактору сайта.
----
 
Информация, представленная на данном сайте, предназначена исключительно для образовательных и научных целей,
не должна использоваться для самостоятельной диагностики и лечения, и не может служить заменой очной консультации врача.
Администрация сайта не несёт ответственности за результаты, полученные в ходе самолечения с использованием справочного материала сайта
Перепечатка материалов сайта разрешается при условии размещения активной ссылки на оригинальный материал.
© 2008 blizzard. Все права защищены и охраняются законом.



 
----