Данный материал перенесен с форума "Компас здоровья" для обеспечения сохранности в связи с частичным удалением с сайта радикал картинок пользователя, разместившего данный материал на форуме и отсутствием ответа на запрос о сложившейся ситуации от владельцев ресурса.

Лапин Сергей Владимирович, к.м.н.
Тотолян Арег Артемович, д.м.н., проф.
Научно-Методический Центр МЗиСР
по Молекулярной Медицине
СП6ГМУ им. акад. И.П. Павлова

197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8
Тел./факс: (812) 499-71-94

Список сокращений [показать]

1   2   3   4

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Классификация

Хотя подробное рассмотрение особенностей лабораторных методов не является задачей данной публикации, понимание основных практических подходов необходимо для обсуждения клинических результатов иммунологических анализов. Граница, отделяющая иммунологические и неиммунологические методы, весьма условна. Другие методы, в том числе цитологические, гистологические, биохимические и молекулярно-биологические, могут использоваться для оценки функций иммунной системы. Иммунологические тесты, основанные на использовании специфических антител, позволяют оценить функции других систем и органов организма.

Под иммунологическими методами подразумеваются тесты, основанные на уникальной способности иммунной системы генерировать специфический иммунный ответ по отношению к экзогенным антигенам. Способность антител связываться с антигенами позволяет использовать их в качестве своеобразных датчиков и широко применяется в медицине и биологии. С помощью специфических антител, получаемых при иммунизации лабораторного животного или гибридомной технологии, можно выявить и измерять количество молекул различных веществ в тканях и биологических жидкостях. Тесты, основанные на количественном определении молекул в составе иммунного комплекса, называют иммунометрическими. Сравнительная чувствительность основных иммунометрических методов приведена в табл. 2.

Образование специфических антител в организме человека при инфекционных заболеваниях, аутоиммунных заболеваниях и опухолях позволяет использовать сами антитела в качестве маркеров заболевания. В этом случае в качестве датчика используется соответствующий инфекционный или аутоантиген. Такие тесты определяют как серологические.

Хотя в развитии аутоиммунных реакций участвуют как гуморальные, так и клеточные механизмы, на сегодняшний день аутоиммунные клеточные ответы охарактеризованы плохо и методы их выявления недостаточно разработаны. В отличие от этого, серологические реакции при аутоиммунных заболеваниях изучены несравненно лучше, и выявление аутоантител широко используется в иммунологической диагностике. Выявление специфических антител роднит аутоиммунные и инфекционные заболевания, при которых серологические тесты играют одну из ведущих ролей в лабораторной диагностике.

В данной главе будет дано описание методов детекции аутоантител, а также мы коснемся методов определения специфических белков иммунной системы и клональности иммуноглобулинов.

Определение LЕ-клеток и другие функциональные тесты

Среди иммунологических тестов функциональными называют методы, которые основаны на определении функций клеточного и гуморального иммунного ответа in vitro. Оценка пролиферативного потенциала лимфоцитов, исследование активности фагоцитирующих клеток и стимулированный синтез цитокинов — все эти тесты описывают клеточные иммунные реакции. Кроме того, функциональные тесты позволяют оценить действие комплексных биологических систем, например системы комплемента. В нее входят более 30 различных белков сыворотки, и отдельное определение всех компонентов привело бы к значительному удорожанию стоимости обследования. Определение общей гемолитической активности комплемента позволяет одновременно оценить функцию всей системы и определить необходимость уточняющих исследований.

В диагностике аутоиммунных заболеваний к функциональным тестам относят те, при которых измерение аутоантител основано на влиянии аутоантител на биологическую реакцию. Присутствие биологической активности антител представляет объективный показатель, в меньшей степени подверженный артефактам иммунометрических тестов.

Недостатком функциональных методов является плохая стандартизация и низкая воспроизводимость, трудоемкость и короткий срок годности компонентов тест-системы. В результате практически всегда функциональные тесты с течением времени заменяются на более простые и надежные иммунометрические и серологические методы.

Большинство функциональных тестов для выявления аутоантител были разработаны еще в середине прошлого века. Обнаружение биологической активности обычно опережало другие методы качественной и количественной оценки аутоантител. Классическим функциональным тестом детекции аутоантител является обнаружение АНА с помощью метода выявления LЕ-клеток (клеток красной волчанки).

LЕ-клетки представляют собой лейкоциты крови, фагоцитировавшие ядра лимфоцитов. В основе этого феномена при СКВ лежит несколько механизмов. Прежде всего, при СКВ лимфоциты периферической крови претерпевают ускоренный апоптоз, который рассматривается как попытка восстановления утраченной иммунотолерантности при этом заболевании. Фагоцитоз ядер лимофоцитов лейкоцитами обусловлен присутствием антинуклеарных антител в сыворотке крови больных, которые опсонизируют фрагменты ядер лимфоцитов, для их поглощения лейкоцитами. Присутствие в тесте сыворотки больного, содержащей антинуклеарные антитела, является принципиальным для обнаружения LЕ-клеток, что позволяет рассматривать этот тест среди других методов выявления АНА.

Еще в начале XX века в пунктатах костного мозга больных с СКВ были описаны гиалиновые тельца в цитоплазме фагоцитирующих клеток и лейкоциты периферической крови, нагруженные клеточным материалом. Этот феномен был смоделирован in vitro в 1948 году Харгрейвзом (Hargraves), Ричмондом (Richmond) и Мортоном (Morton) в клинике Мейо, что привело к созданию лабораторного теста по определению LЕ-клеток. Учет LЕ-клеток осуществлялся в мазке крови с помощью светового микроскопа и гематологических красителей. Благодаря своей условной простоте и дешевизне, этот метод со временем получил широкое распространение. Однако в связи с низкой чувствительностью и сложностью в стандартизации в настоящее время его выполнение в клинических целях не рекомендуется. Надо подчеркнуть, что до сих пор не существует единого рекомендуемого протокола выявления LЕ-клеток, низкая чувствительность тестов требует повторных заборов материала от больного.

Выявление антинуклеарных антител с помощью АНФ полностью исключает необходимость использования этого устаревшего теста. К настоящему моменту обнаружение LЕ-клеток, прежде всего, мотивируется присутствием этого метода в критериях СКВ 1982 года. Однако надо учитывать, что данные критерии составлялись до появления метода обнаружения АНФ на перевиваемых клеточных линиях, а также до внедрения современных методов детекции аутоантител. Это привело к тому, что иммунологический раздел критериев 1982 года значительно устарел. Учитывая низкие аналитические параметры метода определения LЕ-клеток, отрицательный результат даже при повторных анализах не может рассматриваться в качестве повода для исключения возможного диагноза диффузной болезни соединительной ткани.

Дальнейшая история разработки методов обнаружения АНА относится к середине прошлого века. В 1951 году Ли (Lee), Михаел (Michael) и Вурал (Vural) описали сывороточный фактор, ответственный за образование LЕ-клеток и стимулирующий фагоцитоз ядер клеток мононуклеарами крови. Активность фактора наблюдалась во фракции гаммаглобулинов сыворотки крови. Описание этого сывороточного фактора позволило в 1957 году Голоборову (Holoborov), Веиру (Weir) и Джонсону (Johnson) для выявления АНА применить реакцию непрямой иммунофлюоресценции или метод Кунса (Coons, 1950) с использованием в качестве субстрата тканей человека. Модифицированный впоследствии, этот тест на сегодняшний день является основным методом обнаружения АНФ в клинике.

Несмотря на то, что в аутоиммунной диагностике используются единичные функциональные тесты, их роль остается значительной в исследовании патогенетического действия аутоантител. Обнаружение реакции антитела с антигеном в серологических тестах не всегда свидетельствует о наличии антител, обладающих патогенетическим действием in vitro.

К числу функциональных тестов могут быть отнесены исследования животных моделей аутоиммунных заболеваний. Одной из наиболее характерных моделей является индукция аутоантител при иммунизации аутоантигеном лабораторных животных, нокаутированных по гену данного аутоантигена. В этом случае индуцируются высокоаффинные антитела к аутоантигену, которые напоминают аутоантитела, возникающие при аутоиммунном заболевании.

Среди функциональных тестов in vitro, указывающих на присутствие патогенетических аутоантител, необходимо упомянуть обнаружение волчаночного антикоагулянта при антифосфолипидном синдроме с помощью коагулологических тестов, речь о котором пойдет в соответствующем разделе. В этом случае использование функционального теста позволяет улучшить специфичность детекции антифосфолипидных антител, так как многие аутоантитела, направленные к компонентам мембран, не обладают специфической антикоагулянтной активностью.

Иммунофлюоресценция

К иммунофлюоресцентным методам относят иммунологические методы, при которых для выявления иммунного комплекса используют флюоресцирующие вещества (флюорофоры), связанные с антителами. Большинство флюорофоров представляют собой гетероциклические химические вещества, которые способны поглощать излучение с одной длины волны и испускать излучение в другой области спектра. Наиболее популярным флюорофором для выявления аутоантител является флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ), который при освещении невидимым ультрафиолетовым излучением испускает видимый зеленый свет.

Антитела, меченные флюоресцентными красителями, связываются с антигенами, которые фиксированы в ткани либо присутствуют на клетках. Обнаружение свечения флюорофора с помощью люминесцентного микроскопа или фотодетекторов позволяет локализовать антигены, присутствующие в анализируемом субстрате.

Выделяют прямую и непрямую иммунофлюоресценцию. При прямой иммунофлюоресценции тканевые антигены, инфекционные агенты или отложения сывороточных белков в ткани или клетках обнаруживаются с помощью меченных флюорофорами антисывороток или моноклональных антител.

Прямая иммунофлюоресценция используется преимущественно для морфологических исследований биопсий ткани, цитологических и микробиологических исследований. Прямую иммунофлюоресценцию также причисляют к методам иммуногистохимии, которые используются патоморфологами для выявления тканевых антигенов.

В диагностике аутоиммунных заболеваний метод прямой иммунофлюоресценции используется для обнаружения отложений иммуноглобулинов и факторов комплемента в биопсиях кожи и почек. Исследование биопсий кожи с помощью прямой иммунофлюоресценции позволяет выявлять волчаночную полоску при СКВ, локализовать отложения иммуноглобулинов при кожных васкулитах, в частности при пурпуре Шенлейна-Геноха, отложений комплемента в мышечной ткани при полимиозитах. В биопсиях почки многие формы гломерулонефритов сопровождаются характерными отложениями иммуноглобулинов и комплемента. Так, при IgА нефропатии, которая представляет собой наиболее частую форму гломерулонефритов у молодых лиц, наблюдаются отложения IgА и С3 фактора комплемента в мезангии клубочка. При волчаночном нефрите в структурах клубочка обычно отмечаются отложения всех классов иммуноглобулинов, а также С3 и С1q факторов комплемента, которые описываются американскими морфологами как "full-house immunofluorescence".

В отличие от прямого метода, непрямая иммунофлюоресценция относится к серологическим тестам, то есть применяется для обнаружения антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях. В этом случае криосрезы ткани, клетки или микроорганизмы используются как "субстрат", с которым связываются аутоантитела из сыворотки крови обследуемого (табл. 3).

Если в сыворотке присутствуют специфические аутоантитела, то они образуют иммунный комплекс, который фиксируется в тканевом субстрате. Эти иммунные комплексы выявляют с помощью флюоресцентных антисывороток, направленных против иммуноглобулинов человека. Места накопления флюорофора в этом случае соответствуют местам связывания аутоантител с соотвествующими антигенами. Накопление Флюорофора визуализируется с помощью люминесцентного микроскопа. В результате лабораторный сотрудник отмечает характерное свечение окрашенных флюорофорами клеточных и тканевых структур, что позволяет судить о наличии специфических аутоантител (рис. 3. Принцип метода непрямой иммунофлюоресценции для выявления антинуклеарных антител - утрачен с сайта radikal).

Так, при обнаружении антинуклеарного фактора окрашиваются ядра клеток, при выявлении антинейтрофильных антител яркое свечение локализуется в цитоплазме нейтрофилов. При обнаружении антикератиновых антител отмечается свечение в многослойном плоском эпителии пищевода крысы.

Аутоантитела способны связываться с различными структурами в одном субстрате, в результате под люминесцентным микроскопом можно описать разные типы свечения. Так, антинуклеарные антитела могут быть направлены как к антигенам нуклеохроматина, который диффузно распределен в ядре, либо к компонентам ядрышка, которые, хотя и расположены в ядре, представляют отдельные органеллы клетки. Для того чтобы различить эти варианты выявления антинуклеарных антител, наряду с титром антинуклеарного фактора, описывается "тип свечения" ядра клетки - гомогенный тип свечения, центромерный тип свечения, периферический тип свечения, ядрышковый тип свечения, гранулярный тип свечения, цитоплазматический тип свечения (см. рис. типы свечения АНФ в соответствующем разделе).

Типы свечения могут быть описаны при выявлении антинейтрофильных антител, антикератиновых антител, антимитохондриальных антител и многих других. Обычно каждому типу свечения соответствует своя антигенная мишень, антитела к которой могут быть обнаружены в сыворотке.

В то же время в одном и том же субстрате могут быть обнаружены различные специфичности аутоантител. На клетках НЕр-2 могут быть выявлены как антинуклеарные антитела, так и антитела к митохондриям. При выявлении антикератиновых антител зачастую обнаруживается антинуклеарный фактор, а также могут быть обнаружены антитела к гладким мышцам. Наиболее широкий спектр аутоантител может быть выявлен при использовании так называемого "тройного субстрата", представляющего собой срезы трех тканей крысы: печени, почки и желудка. Его использование позволяет обнаружить наиболее часто встречающиеся разновидности аутоантител, а именно: антинуклеарные антитела, антимитохондриальные антитела, антитела к гладким мышцам и антитела к обкладочным клеткам желудка. Однако со времени внедрения серологического тестирования на перевиваемых клеточных линиях, основным субстратом для выявления аутоантител стала перевиваемая клеточная линия НЕр-2.

Таким образом, несомненным преимуществом непрямой иммунофлюоресценции является возможность оценки одновременного связывания аутоантител со всем разнообразием антигенов, которое имеется в тканевом субстрате. Описание типа свечения, характерного для конкретной разновидности аутоантител, позволяет определить последующие тесты для уточнения специфичности аутоантител. Это делает иммунофлюоресценцию удобной для скринингового использования и обуславливает большое значение этого метода в аутоиммунной диагностике. Хотя метод непрямой ммунофлюоресценции сравнительно дешев, его объективными недостатками является субъективность учета результатов и трудоемкость.

Преципитация и агглютинация частиц в растворе

По мере укрупнения иммунного комплекса, образующегося при взаимодействии между антителом и антигеном, нарушается его растворимость. Иммунопреципитация лежит в основе ряда иммунометрических методов и позволяет оценить количество антител или антигена, присутствующих в изучаемом образце. При добавлении антител к постоянной концентрации антигена преципитация постепенно нарастает прямо пропорционально увеличению размеров иммунных комплексов. После достижения плато происходит растворение иммунных комплексов под действием нарастающей концентрации антител с образованием мелких более растворимых комплексов.

Для макроскопической оценки преципитации требуются значительные количества антител и антигена, поэтому для оценки процесса преципитации иммунного комплекса используется измерение оптических свойств раствора. На иммунопреципитации построены методы нефелометрии и турбидиметрии, широко используемые в лабораториях для исследования сывороточных белков.

Процесс, приводящий к преципитации покрытых антигеном микрочастиц под действием антител, называют агглютинацией. Микрочастицы, поддерживаются в растворе в виде суспензии за счет электростатических сил отталкивания. Антитела, реагирующие с антигеном, сорбированным на их поверхности, образуют связи между частицами, что позволяет преодолеть силы отталкивания с образованием нерастворимых агрегатов.

В классических серологических тестах в качестве частиц-носителей использовались эритроциты, в данном случае метод назывался гемагглютинация. Более стабильные суспензии образуют частицы полистирола (латекса) или желатина, что позволяет добиться большей стандартизации агглютинационных тестов. Эффективность агглютинации зависит от количества связей между частицами. Агглютинация под действием антител класса IgМ более эффективна, по сравнению с агглютинацией опосредованной IgG, что обусловлено большей валентностью молекул IgМ, содержащей 10 aнтиген-связывающих участков.

Турбидиметрия, нефелометрия и латекс-агглютинация обладают сравнительно низкой чувствительностью, поэтому для выявления аутоантител используются ограниченно. Данные методы применяются в клинике для обнаружения ревматоидного фактора — частой разновидности аутоантител, представленной преимущественно IgМ.

Сравнительно недавно шире стали использоваться тесты, основанные на объединении агглютинации и преципитации. В этом случае антиген нанесен на поверхность латексных частиц, но процесс агглютинации учитывается по изменению светопропускания раствора. Такая комбинация значительно увеличивает чувствительность метода, что делает возможным использование этого метода в целях выявления большего числа аутоантител

Двойная иммунодиффузия и контрэлектрофорез

Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони является сравнительно грубым методом определения специфичности аутоиммунной сыворотки, однако обладает высокой специфичностью. Метод основан на преципитации комплексов антиген-антитело в агарозном геле (рис. 4. Принцип метода двойной иммунодиффузии в агарозе по Оухтерлони для выявления конкретных типов АНД - утрачен с сайта radikal).

Сыворотка больного и аутоантиген вносятся в лунки агарозного геля, расположенные на небольшом расстоянии друг от друга. Постепенная диффузия содержимого лунок создает градиент концентраций антитела и антигена, а линия преципитации образуется там, где соотношение антиген-антитело оптимально для образования иммунного комплекса. В методе двойной иммунодиффузии может использоваться богатый антигенами неочищенный тканевой экстракт, что позволяет одновременно определять антитела к нескольким антигенам.

Для обнаружения антинуклеарных антител сыворотка больного и референтные сыворотки, в каждой из которых содержатся антитела только одной специфичности, располагаются в агарозных лунках поблизости от лунки с антигеном. В качестве антигена используются водно-солевые экстракты клеточных линий или ткани, содержащие смесь ядерных антигенов.

Для выявления антинуклеарных антител используется экстрагируемый ядерный антиген (ЭНА), представляющий собой ядерный экстракт из тимуса кролика с примесью экстракта из человеческой селезенки, обеспечивающего достаточное содержание Rо/SS-А антигена. Антитела и антигены диффундируют из лунок навстречу друг другу с образованием через 24-48 часов преципитиновых линий. После окрашивания геля регистрируют наличие линий преципитации антигена и сыворотки больного, а также устанавливают ее идентичность с референтной сывороткой.

Отсутствие линии преципитации указывает на отсутствие аутоантител к ЭНА в данной сыворотке. Если же обнаруживается линия преципитации, то она может быть охарактеризована при сравнении с линией преципитации, образованной референтными сыворотками. Если линия преципитации сыворотки больного представляет собой продолжение линии преципитации референтной сыворотки с известной антигенной специфичностью, то у больного имеются АНА той же разновидности, что и антитела в референтной сыворотке. Если же линии преципитации не сливаются, то в сыворотке больного нет антител данной специфичности.

Разделяют скрининговый и подтверждающий тесты. В первом случае регистрируется появление линии преципитации между сывороткой и ЭНА, в случае подтверждающего теста оценивается совпадение линии преципитации исследуемой и референтной сывороток.

Метод двойной иммунодиффузии был одним из первых, который стал широко использоваться для практического выявления разновидностей аутоантител. Применение метода иммунодиффузии позволило более точно охарактеризовать различные аутоантитела к компонентам клетки, что привело к описанию подтипов АНА, таких как Sm, snRNP, Rо/SS-А, LA/SS-В и Scl-70. Двойная иммунодиффузия является относительно слабочувствительным методом по сравнению с другими тестами по выявлению АНА, требуя больших количеств антител (до 100 мкг) для образования видимых линий преципитации. Однако ее сравнительно низкая чувствительность обеспечивает высокую специфичность этого метода для выявления АНА.

Иммунодиффузия позволяет обнаружить антитела ко всем растворимым экстрагируемым ядерным антигенам, в том числе к PCNA и растворимым ядрышковым компонентам, таким как РМ-Scl. Этот метод не позволяет выявлять антитела против редких и информационных антигенов, например, антинуклеолярных антител или антител к U3-RNР, а также нерастворимых антигенов, таких как ДНК и гистоны.

Метод двойной иммунодиффузии не требует использования специальных приборов или наборов высокоочищенных антигенов, что представляет значительные преимущества для клинического применения. Однако большая длительность теста и низкая чувствительность существенно ограничивают его использование.

Значительно ускорить время иммунопреципитации в геле можно с помощью контрэлектрофореза — разновидности метода двойной иммунодиффузии. Электромагнитное поле, приложенное к гелю, значительно ускоряет время диффузии белков. Кислые антигены диффундируют из катодной лунки, а антитела — из анодной лунки. Метод требует значительно меньших количеств антител и антигена (до 0,1 мг), но, как и двойная иммунодиффузия, позволяет получить только качественный результат. Спектр определяемых типов АНА у двойной иммунодиффузии и контрэлектрофореза принципиально схож.

Двойная иммунодиффузия и контрэлектрофорез завоевали свое место в лабораторной практике благодаря своей относительной дешевизне и простоте выполнения методов. Низкая чувствительность методов не является помехой, так как антитела к экстрагируемым ядерным антигенам обычно встречаются в очень высоких концентрациях, составляя существенную часть всего пула иммуноглобулинов сыворотки.

Иммуноферментный метод

В методе ИФА детекция иммунного комплекса дополнена усилением сигнала за счет каталитического фермента. Разведения сыворотки инкубируют в лунках полистирольного или поливинилового 96-луночного планшета, дно которых покрыто рекомбинантным либо высокоочищенным антигеном. Это позволяет специфическим антителам связаться со своими мишенями. Связавшиеся с антигеном антитела сыворотки больного визуализируют с помощью античеловеческой сыворотки, несущей фермент. Активность фермента в отношении хромогенного субстрата дает возможность судить о концентрации аутоантител. Использование стандартов, содержащих известные количества аутоантител, позволяет построить калибровочную кривую для вычисления их количественного содержания в сыворотке пациента.

Данный метод позволяет быстро и надежно получить количественный результат относительно содержания аутоантител в сыворотке крови больного. На сегодняшний день иммуноферментный анализ является основным методом определения аутоантител в небольших клинических лабораториях. Хотя его достоинства неоспоримы, ИФА не лишен недостатков. Прежде всего, они касаются специфичности метода. Наряду с аутоантителами, в каждой сыворотке присутствуют низкоаффинные полиспецифичные антитела, которые конкурируют с высокоаффинными антителами за связывание с антигеном. Содержание иммуноглобулинов может значительно варьировать в каждом конкретном образце, и сыворотки с высоким содержанием иммуноглобулинов дают большую частоту неспецифических реакций. Метод ИФА позволяет преимущественно определять низкоаффинные антитела, количество которых зависит от поликлонального синтеза, в отличие от метода непрямой иммунофлюоресценции, при котором конечный титр отражает аффинность аутоантител. Таким образом, метод ИФА предоставляет высокую чувствительность в обмен на низкую специфичность. Это особенно касается выявления антител к дсДНК, а также антител к экстрагируемым ядерным антигенам.

Для обеспечения специфичности тестов необходима высокая степень очистки белков, и малейшее загрязнение антигенов приводит к значительному увеличению числа ложноположительных ответов, учитывая высокую чувствительность метода детекции. Тканевые экстракты обычно загрязнены митохондриальными и ядерными антигенами, что может привести к ложноспецифическим реакциям в тех сыворотках, в которых имеются данные аутоантитела. Наилучшие результаты выявления аутоантител могут быть получены при использовании рекомбинантных антигенов, экспрессированных в эукариотических системах продукции белков, так как примеси бактериальных компонентов снижают специфичность выявления аутоантител. Методы очистки белка способны в определенной степени изменить антигенную структуру, что приводит к значительным вариациям в специфичности и чувствительности коммерческих наборов для ИФА. Воспроизводимость результатов и стандартизированность наборов в этом случае составляют основу качества клинического анализа, что требуют решения вопроса о внутри- и межлабораторном контроле качества. Для получения сравнимых результатов рекомендуется использование реактивов одного производителя. Производители коммерческих тест-систем не всегда подробно указывают метод получения антигена, качество его очистки, в связи с чем анализ причин неспецифических реакций обычно невозможен.

Улучшение специфичности выявления аутоантител может быть достигнуто в случае использования тест-систем, основанных на сэндвич-ИФА (antigen capture ELISA). В этом случае для иммобилизации антигена на планшете используются моноклональные антитела, способные захватить антиген из раствора. При этом не требуется предварительной очистки антигена и ковалентной иммобилизации антигена на твердой фазе, что позволяет сохранить белки в нативном состоянии. С другой стороны, сэндвич-ИФА сохраняет все преимущества традиционного ИФА-метода, включая высокую чувствительность и простоту анализа. К сожалению, наборов выявления аутоантител, основанных на сэндвич-ИФА, немного.

Неоспоримым преимуществом твердофазного иммуноферментного анализа является возможность его автоматизации, что уменьшает трудозатраты и делает тест более стандартизированным. В настоящее время разработан ряд методов, которые составляют альтернативу традиционному "плашечному" ИФА. Так, антиген может быть нанесен на стеклянный фильтр или распределен на керамическом чипе, может быть использована флюоресцентная или хемилюминесцентная система детекции. Использование чиповых технологий позволяет миниатюризировать сам метод и значительно снижает себестоимость обследования пациента.

Иммуноблоттинг и радиоиммунопреципитация

Иммуноблоттинг (Western-blot) представляет собой один из наиболее чувствительных и специфичных методов анализа антигенной специфичности антител сыворотки больного. В основе этого метода лежит электрофорез антигенов в полиакриламидном геле с последующим перенесением (блоттингом) на нитроцеллюлозную мембрану белкового материала, фракционированного в соответствии с зарядом и массой антигенов. После этого мембрана блокируется индифферентным белком для предотвращения неспецифического связывания антител. Далее мембрана с нанесенными на нее белками инкубируется с сывороткой, содержащей антитела. После связывания антител с соответствующими мишенями, комплексы антиген-антитело выявляются с помощью античеловеческой сыворотки, меченной ферментом. На последнем этапе фермент-содержащие комплексы визуализируют с помощью ферментного субстрата, окисление которого приводит к образованию нерастворимых, окрашенных продуктов ферментативной реакции в месте расположения комплексов.

Этот метод позволяет обнаружить сывороточные антитела и описать соответствующие им антигены в зависимости от их молекулярной массы. Этот метод не требует высокоочищенных антигенов, референтных и контрольных сывороток. Идентификация мишени аутоантител основана на молекулярном весе белка, с которым реагируют аутоантитела из сыворотки пациента. В одной реакции может быть обнаружено связывание антител с несколькими антигенами, каждый из которых может быть точно охарактеризован. За счет этого иммуноблоттинг обладает рядом преимуществ перед другими методами выявления аутоантител, результаты которых зависят от стандартизации, чувствительности, качества субстрата, нестабильности или нерастворимости определенных антигенов. Тем не менее, при электрофорезе возможно разрушение определенных конформационных эпитопов, что несколько снижает чувствительность метода. Кроме того, иммуноблоттинг позволяет провести только качественный анализ.

По чувствительности иммуноблоттинг сравним с иммуноферментным методом, однако в классическом варианте требует значительного опыта и весьма трудоемок. За последние несколько лет широкое распространение получили методы, основанные на дот (слот)-блоттинге. В этом случае на нитроцеллюлозную мембрану через тонкие прорези наносятся чистые рекомбинантные антигены. Таким образом, на одном листке может быть получен отпечаток 10-20 различных белков. Количество расходуемых антигенов в несколько раз меньше, чем при типичном ИФА-методе, что снижает стоимость обследования. Хотя слот-блоттинг дает в лучшем случае полуколичественный ответ, не лишен проблем со стабильностью и сохранностью антигенов, однако его высокая чувствительность и сравнительная дешевизна делают его одним из базовых тестов для выявления основных специфичностей антител.

Радиоиммунные тесты в практической диагностике аутоиммунных заболеваний используются ограниченно. Всего три задачи решаются с помощью радиоиммунных тестов. Они включают выявление антител к дсДНК (см. ниже), антитела к ацетилхолиновому рецептору и рецептору тиреотропного гормона. В то же время радиоиммунопреципитация остается одним из совершенных аналитических методов поиска новых антигенов аутоантител, основанных на иммуноблоттинге. С помощью радиоиммунопреципитации были точно охарактеризованы большинство минорных антигенов антинуклеарных антител. В качестве антигенов в этом методе используются ядерные экстракты человеческих клеточных линий, таких как К562 или НеLа, культивируемых в присутствии аминокислот, меченных изотопами. После связывания антигенов и антител в растворе иммунные комплексы преципитируют, после чего подвергают аналитическому электрофорезу в полиакриламидном геле.

Ауторадиография позволяет идентифицировать белки и тем самым установить точную специфичность антител. Использование меченных изотопами белков и нуклеиновых кислот делает этот метод чрезвычайно чувствительным и позволяет применять его в качестве стандарта по отношению к другим методам. Так как нет необходимости в предварительной очистке субстрата, антигены представлены в нативном виде. Связывание антигена и антитела происходит в растворе, что теоретически соответствует условиям реакций in vivo.

Тесты по определению антител к дсДНК

В связи с особым клиническим значением этой разновидности АНА в диагностике СКВ и определенными методическими сложностями, с которыми связано определение антител к ДНК, необходимо отдельно остановиться на лабораторных методах по выявлению этой разновидности антител. Можно сказать, что методические особенности, с которыми связано выявление антител к двуспиральной ДНК, отражают все основные аспекты выявления аутоантител и подчеркивают сложности в интерпретации результатов серологического обследования при аутоиммунных заболеваниях.

Антитела к ДНК направлены на рибозофосфатный скелет молекулы и способны связываться как с односпиральной, так и двуспиральной ДНК. В то же время антитела к дсДНК (нативной) перекрестно реагируют с осДНК (денатурированной), что затрудняет интерпретацию результатов теста, если в качестве антигена выступает дсДНК, загрязненной осДНК.

Низкоспецифичные антитела к осДНК, встречающиеся при различных аутоиммунных и инфекционных заболеваниях, включая СКВ, лекарственную волчанку, ревматоидный артрит, хронический активный гепатит и инфекционный мононуклеоз, распознают денатурированные одноцепочечные фрагменты дсДНК. Их способность связываться со свободными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями в составе дсДНК приводит к тому, что антитела к осДНК нередко выявляются в тестах, направленных на определение антител к дсДНК.

Таким образом, для выявления антител к дсДНК, которые встречаются только при СКВ и входят в число наиболее специфичных маркеров этого заболевания, требуется использовать тесты, которые позволили бы выявлять связывание антител только с дсДНК.

Для выявления антител к дсДНК используются метод ИФА, непрямая иммунофлюоресценция и радиоиммунный тест.

Метод ИФА не обеспечивает достаточную специфичность выявления антител к дсДНК. Молекула дсДНК несет отрицательный заряд и не может быть непосредственно нанесена на отрицательно заряженный пластик иммуноферментного планшета. Для того чтобы нанести ДсДНК на дно лунок, необходимо использовать белок-посредник. Так, дно лунок может быть предварительно покрыто протамином, сывороточным белком, несущим значительный положительный заряд, позволяющий связывать отрицательно заряженные молекулы дсДНК. Определенная часть молекул деспирализуется, что приводит к образованию осДНК. Кроме того, осДНК с большим сродством связывается с пластиком, из которого изготовлены планшеты для ИФА. Это приводит к тому, что большинство твердофазных иммуноферментных систем для обнаружения антител к дсДНК оказываются относительно неспецифичными. Практическим ревматологам необходимо знать об этой особенности выявления антител к ДсДНК и с осторожностью интерпретировать низкие титры этого показателя.

Мы сопоставили результаты обнаружения антител к дсДНК и АНФ у больных, направленных в лабораторию на обследование по поводу СКВ (табл. 4).

Из представленных данных видно, что специфичность выявления антител к дсДНК в рекомендованном производителем титре >25 МЕ/мл составляет 91%, то есть каждый 10-й выполненный тест по обнаружению аутоантител с помощью ИФА является ложноположительным. Если в качестве границы нормы выявления антинуклеарных антител использовать уровень 50 МЕ/мл, то специфичность обследования возрастает до 97%, то есть только каждый 30-й тест является ложноположительным. Однако такое изменение в диагностическом титре приводит к снижению встречаемости антител к дсДНК более чем в 2 раза. Это заставляет нас выделять "серую зону", куда попадают все результаты обнаружения аутоантител между 25 и 50 МЕ/мл. В этом случае клиницисту самому приходится решать, насколько результат теста укладывается в клиническую картину заболевания. Это заставило искать альтернативу методу ИФА, который позволил бы увеличить специфичность обследования пациентов.

Такой альтернативой служит метод непрямой иммунофлюоресценции, который позволяет использовать субстрат, содержащий неизмененную молекулу дсДНК. В качестве субстрата используются клетки простейшего жгутикового микроорганизма Crithidia luciliae (рис. 6).

Этот микроорганизм относится к роду трипаносом, он неприхотлив и хорошо поддается культивированию в лабораторных условиях. В основании жгутика в клетках критидий имеется кинетопласт, состоящий из гигантской митохондрии, содержащей плотно упакованную кольцевую, суперспиральную молекулу ДНК. Эта молекула митохондриальной дсДНК, не содержащая ассоциированной РНК и нуклеопротеинов, представляет идеальный субстрат для непрямой иммунофлюоресценции. Так как ядро критидий не обладает четкой мембраной, даже высокие титры АНФ не мешают оценить специфическое свечение кинетопласта.

При наличии у больного антител к дсДНК, реагирующих с ДНК в кинетопласте, определяется яркая флюоресценция на конце клетки, несущем жгутик. Наличие гистонов в составе ДНК кинетопласта может привести к ложноположительному результату у больного, имеющего антитела к гистонам.

Как и другие иммунофлюоресцентные методы, тест с использованием С. luciliae позволяет получить только полуколичественный результат, поэтому его целесообразно комбинировать с методом ИФА.

Наилучшим методом выявления антител к дсДНК является метод радиоиммунного анализа, известного как тест Фарра (Farr test). Метод Фарра относится к классическим методам фундаментальной иммунологии, с помощью которого исследуют аффинность связывания антитела с антигеном. Реакция связывания антител с дсДНК, меченной радиоактивным изотопом, протекает в растворе, что позволяет предотвратить деспирализацию ДНК. Образовавшиеся иммунные комплексы дсДНК и анти-дсДНК антител осаждаются с помощью насыщенного раствора сульфата аммония. Преципитат многократно отмывается, и содержание радиоактивной метки считывается в счетчике радиоактивности. Результат теста выражается либо в проценте связывания дсДНК, либо в единицах радиоактивности.

На принципе радиоиммунопреципитации основан и другой метод, часто используемый для определения антител к дсДНК, при проведении которого преципитация комплексов антител и дсДНК происходит под действием полиэтиленгликоля (ПЭГ). Благодаря своей высокой точности, тест Фарра используется в качестве "золотого стандарта" количественного определения антител к дсДНК. Применение растворимых форм дсДНК предотвращает деспирализацию и контаминацию осДНК, что обеспечивает высокую специфичность и надежность этого анализа. Этим методом измеряется содержание преимущественно высокоаффинных антител к дсДНК в отличие от ИФА, который обнаруживает аутоантитела с низким сродством к дсДНК, встречающиеся при других аутоиммунных заболеваниях, в том числе ревматоидном артрите, склеродермии, аутоиммунном гепатите и тиреоидите Хашимото.

Радиоиммунные лаборатории доступны далеко не везде и несмотря на то, что выявление антител к дсДНК методом радиоиммунного анализа входит в ряд клинических индексов оценки активности СКВ, для практического использования применяют метод ИФА и иммунофлюоресцентный тест на С. luciliae. В этом случае иммунофлюоресценция используется для скрининга аутоантител, и при выявлении специфического связывания аутоантител количественный результат может быть получен с помощью ИФА. Сочетание двух методов является эффективным инструментом для выявления антител к дсДНК и для мониторинга их содержания в сыворотке больного СКВ.

Стандартизация и контроль качества иммунологических тестов

Стандартизация является подходом лабораторной диагностики, с помощью которого достигается сопоставление результатов разных методов и тестов между собой. Для сопоставления результатов необходимо использовать единые «референтные» материалы, в которых содержится известное количество анализируемого вещества. Для создания референтных сывороток необходимо получение достаточного количества одинакового биоматериала, которому присваивают условные единицы концентрации. Одной из основных проблем стандартизации серологических тестов является отсутствие физической величины содержания аутоантител, так как большинство тестов измеряют не только концентрацию, но и аффинность антител в сыворотке.

Первые попытки стандартизации и создания референтных сывороток, содержащих антинуклеарные антитела, были предприняты в США в 1980 году Arthritis Foundation совместно с Centers for Disease Control (СDС), г. Атланта, США. В 1982 году Комитетом по серологии антинуклеарных антител (Committee on Antinuclear Antibody Serology) было выпущено пять референтных сывороток, которые могли служить стандартами для описания типа флюоресценции АНФ, а также для выявления основных антител к экстрагируемому ядерному антигену в реакции иммунодиффузии и контрэлектрофореза.

Инициатива была поддержана рядом международных организаций, таких как Международная лига по борьбе с ревматизмом (International League Against Rheumatism), Международный союз иммунологических обществ (International Union of Immunological Societies) и Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ). В настоящее время количество референтных сывороток ВОЗ составляет 10, включая пять основных типов флюоресценции и 7 разновидностей ЭНА, в том числе анти-дсДНК, Lа/SS-В, U1-RNP, Sm, Rо/SS-А, Scl-70 и Jo-1 (табл. 5). Они обеспечивают необходимую стандартизацию всех тест-систем для клинического обнаружения антинуклеарных антител.

Таблица 5. Основные референтные сыворотки для стандартизации выявления аутоантител при ревматических заболеваниях, рекомендованные Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ)
Определяемый показатель	Стандарт	Содержание аналита
Антинуклеарные антитела, гомогенный тип свечения	WHO 1064	100 ME/мл
Антитела к дсДНК	Wo80	100 ME/мл
Антитела к экстрагируемым ядерным антигенам и типы свечения АНФ	AF-CDC-ANA 1-10	Стандарты гомогенного, гранулярного, нуклеолярного и центромерного типов свечения, а также антитела к дсДНК, U1-RNP, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1 антигенам
Ревматоидный фактор	WHO 1066	100 ME/мл
Антикардиолипиновые антитела	97/ 656	Стандарт содержания GPL/мл и MPL/мл

При стандартизации тестов для выявления антител к дсДНК используется референтная сыворотка ВОЗ Wo/80, которая содержит 100 МЕ/мл. По этой сыворотке стандартизировано большинство коммерческих тест-систем, а также в МЕ оцениваются результаты внешнего контроля качества. Общепризнанным стандартом является также сыворотка ВОЗ для стандартизации выявления РФ WHO1066, по которой стандартизовано большинство соответствующих тест-систем. Однако далеко не все разработанные стандарты сывороток получили широкое распространение, что связано с их доступностью и удобством использования производителями тест-систем. Большинство производителей коммерческих тестов для стандартизации своих наборов используют собственные стандарты, что затрудняет сопоставление результатов обследования в разных лабораториях.

Контроль качества клинических анализов диктуется необходимостью стандартизации собственных внутрилабораторных методов, результаты которых зависят от опыта и прилежности персонала и качества реагентов. Использование коммерческих тест-систем не избавляет от необходимости контролировать точность полученных результатов, так как их качество может существенно варьировать.

Внутрилабораторный контроль качества, применяемый в повседневной работе, осуществляется несколькими способами. Прежде всего, это создание собственных стандартов сыворотки, содержащей целевые антитела, а также регулярное построение калибровочных кривых, включение в тест-систему отрицательных, низкоположительных и высокоположительных сывороточных контролей. Регистрация результатов внутрилабораторного контроля качества позволяет оценить ошибку метода и его воспроизводимость. Этот контроль необходим для текущего тестирования качества реагентов и точности лабораторных манипуляций.

Внешний контроль качества осуществляется региональными, федеральными и международными программами контроля качества лабораторных исследований. Для участия в международных программах требуется сандартизация используемых методов по референтной сыворотке, что позволяет выражать результаты тестов в общепринятых единицах, например в IU/мл. В рамках таких программ осуществляется рассылка контрольных материалов, представляющих собой образцы сыворотки больных аутоиммунными заболеваниями. В пределах означенного срока лаборатория предоставляет результаты тестов в контролирующие организации, которые обобщают данные участвующих лабораторий. Соответствие результатов конкретной лаборатории результатам тестов, проведенных в других лабораториях, позволяет сделать заключение о качестве работы этой лаборатории. В соответствии с европейскими рекомендациями оценки качества лабораторных исследований, качество теста признается удовлетворительным, если результат лаборатории находится внутри интервала М±10% крупнейших референсных лабораторий, участвующих в исследовании.

Существует несколько крупных международных программ контроля качества иммунологических исследований, в частности программа UK NEQAS в Великобритании (http://www.imqas.org.uk), программа Американского Колледжа Патологов, WHO CLB в Голландии, Labquality в Финляндии (http://www.labquality.fi). Крупные производители реактивов, такие как BIO-RAD (США) и РАNDОХ (Англия), поддерживают собственные программы контроля качества лабораторных исследований, которые включают ряд серологических тестов для диагностики аутоиммунных заболеваний. Количество программ контроля качества аутоиммунной диагностики увеличивается по мере увеличения числа лабораторий, предлагающих клиническое тестирование для выявления аутоантител.

С финансовой точки зрения, участие всех клинических лабораторий в международных программах очень дорого и непрактично, что требует создания местных, региональных и федеральных стандартов, а также развития региональных и федеральных программ внешнего контроля качества, опирающихся на несколько крупных референтных лабораторий, участвующих, в свою очередь, в международных программах.

1   2   3   4