Автоматизированное исследование клеток крови

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
21 марта 2007 г. N 2050-РХ
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ АНАЛИЗАТОРЫ. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ АНАЛИЗА КРОВИ

Утверждаю

Заместитель Министра
здравоохранения и социального
развития Российской Федерации
Р.А.ХАЛЬФИН

Список сокращений [показать] .

АА	Апластическая анемияр	ЭПО	Рекомбинантный эритропоэтин	IRF	Фракция незрелых ретикулоцитов	SSC	Боковое светорассеяние
АИГА	Аутоиммунная гемолитическая анемия	CHr	Содержание Hb в ретикулоцитах	LFR	Ретикулоциты с низкой флюоресценцией	sTfR	Растворимые рецепторы к трансферрину
АХЗ	Анемия хронических заболеваний	CRC	Скорректированный подсчет ретикулоцитов	MCV	Средний объем эритроцитов	RBC	Количество эритроцитов (10¹²/л)
ЖДА	Железодефицитная анемия	FSC	Прямое светорассеяние	MCVr (MRV)	Средний объем ретикулоцитов	RDW-CV	Показатель анизоцитоза эритроцитов
НТЖ	Насыщение трансферрина железом	HGB	Концентрация гемоглобина в крови	MCH	Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах	Ret	Ретикулоциты
ОЖСС	Общая железосвязывающая способность сыворотки	HFR	Ретикулоциты с высокой флюоресценцией	MCHC	Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах	RET#	Количество ретикулоцитов (10⁹/л)
ОПГА	Острая постгеморрагическая анемия	HLR%	Процент незрелых ретикулоцитов	MFR	Ретикулоциты со средней флюоресценцией	Ret-He	Содержание Hb в ретикулоцитах
ХПН	Хроническая почечная недостаточность	HLR#	Абсолютное количество незрелых ретикулоцитов	MSRV (MSCV)	Средний объем сферических ретикулоцитов	RET%	Количество ретикулоцитов (%)
ЭПО	Эритропоэтин	Ht, НСТ	Гематокрит	PLT	Количество тромбоцитов (10⁹/л)	RPI	Индекс продукции ретикулоцитов
эЭПО	Эндогенный эритропоэтин	% Hypo	Процент гипохромных эритроцитов	SFL	Канал специфического флюоресцентного сигнала	WBC	Количество лейкоцитов (10⁹/л)

АВТОМАТИЗИРОВАННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК КРОВИ

Автоматические счетчики крови оценивают размеры, структурные, цитохимические и другие характеристики клеток. Они анализируют около 10000 клеток в одном образце и имеют несколько различных каналов подсчета клеточных популяций и концентрации гемоглобина. На основании количества определяемых параметров и степени сложности их можно условно разделить на 3 основных класса:

I класс - автоматические гематологические анализаторы, определяющие до 20 параметров, включая расчетные показатели красной крови и тромбоцитов, гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, а так же частичную дифференцировку лейкоцитов на три популяции - лимфоциты, моноциты и гранулоциты. К анализаторам I класса относятся гематологические анализаторы, поставляемые в рамках приоритетного национального проекта "Здоровье" в 2006 г. в клинико-диагностические лаборатории амбулаторно-поликлинического звена здравоохранения: MEK-6400J/K фирмы Nihon Kohden (Япония), Адвия 60 фирмы Bayer (Германия), COULTER Ac*T фирмы Beckman Coulter (Франция).
II класс - высокотехнологичные гематологические анализаторы, позволяющие проводить развернутый анализ крови, в том числе полную дифференцировку лейкоцитов по 5-ти параметрам (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты), гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, скатерограммы (Pentra-60, Cell-Dyn 3700, МЕК-8222).
III класс - сложные аналитические системы, выполняющие не только развернутый анализ крови с дифференцировкой лейкоцитов по 5 параметрам, но и подсчет и анализ ретикулоцитов, некоторых субпопуляций лимфоцитов; при необходимости комплектуются блоком для автоматического приготовления и окраски мазков из заданных образцов крови (Sysmex ХЕ-2100, Coulter LH750, Advia 2120, Pentra 120).

В основе работы анализаторов I-го класса лежит кондуктометрический метод. Анализаторы II и III-го классов используют в своей работе комбинации разных методов.

Кондуктометрические гематологические анализаторы [показать] .

Технология автоматического подсчета клеток была разработана в 1947 г. Wallace Н. и Joseph R. Coulter. Апертуро-импедансный метод (метод Культера или кондуктометрический метод) основан на подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Если через узкий канал, заполненный электропроводящим раствором, проходит клетка крови, то в этот момент сопротивление электрическому току в канале возрастает (рис. 10 - не приводится). Несмотря на то, что изменение сопротивления невелико, современные электронные приборы легко его улавливают. Каждое событие - прохождение клетки через канал, сопровождается появлением электрического импульса. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать число электрических импульсов, которые при этом генерируются.

Если в один и тот же момент в канале находятся две клетки, они регистрируются в виде одного импульса, что приведет к ошибке подсчета клеток. Во избежание этого, проба крови разводится до такой концентрации, при которой в канале датчика всегда будет не больше одной клетки.

Апертуро-импедансный метод позволяет определять большинство эритроцитарных и тромбоцитарных показателей, связанных с объемом клеток (НСТ, MCV, МСН, МСНС, MPV), а также является основой для дифференцировки лейкоцитов по трем параметрам.

Подсчет эритроцитов и тромбоцитов, расчет величины гематокрита, эритроцитарных и тромбоцитарных индексов

Разделение эритроцитов и тромбоцитов в современных анализаторах проводится по измерению амплитуды электрического сигнала: тромбоциты (небольшие по размеру клетки) при прохождении измерительного канала генерируют электрические импульсы низкой амплитуды, а сравнительно большие клетки - эритроциты и лейкоциты - импульсы высокой амплитуды (рис. 11 - не приводится). После лизиса эритроцитов в суспензии остаются лейкоциты. Из первого счета импульсов высокой амплитуды вычитают импульсы высокой амплитуды второго счета (лейкоциты). Разница импульсов высокой амплитуды до и после лизиса соответствует количеству эритроцитов - RBC (Red Blood Cells).

Устройство, которое разделяет импульсы по величине амплитуды, называется дискриминатор. В современных анализаторах применяются многоканальные дискриминаторы, позволяющие получить детальную информацию о размерах клеток в виде гистограмм, поскольку каждый канал соответствует определенному объему клеток.

При суммировании амплитуд импульсов, получаемых при подсчете количества эритроцитов, получается величина, отражающая общий объем, занимаемый эритроцитами, то есть гематокрит Hct (hematocrit). Разделив гематокритную величину на концентрацию эритроцитов (RBC), получается полезная характеристика эритроцитов - средний объем MCV (mean corpuscular volume).

Очевидно, что аналогичные показатели можно получить и для тромбоцитов: концентрация тромбоцитов - PLT (platelet), тромбокрит - РСТ (platelet crit), средний объем тромбоцитов - MPV (mean platelet volume).

Поскольку в норме концентрация эритроцитов в крови на 3 порядка превышает концентрацию лейкоцитов, то вклад лейкоцитов в общее количество подсчитываемых клеток пренебрежимо мал по сравнению с эритроцитами, поэтому в некоторых анализаторах за количество эритроцитов принимают общее подсчитанное количество клеток. Такое допущение справедливо, за исключением случаев явных лейкоцитозов.

Подсчет и дифференцировка лейкоцитов

Определение количества лейкоцитов возможно только после лизиса эритроцитов. Эта задача оказалась легко решаемой, так как свойства мембран эритроцитов и лейкоцитов существенно различаются. Эритроциты легко лизируются под воздействием многих поверхностно-активных веществ, при этом лейкоциты, хотя и претерпевают некоторые изменения, остаются целыми. Поэтому при подсчете лейкоцитов, прежде чем пропустить разведенную суспензию крови через апертуру датчика, к ней добавляют лизирующий раствор или гемолитик, эритроциты разрушаются до очень мелких фрагментов, которые при подсчете лейкоцитов генерируют электрические импульсы очень низкой амплитуды, не влияющие на результат анализа.

Разделение неизмененных лейкоцитов кондуктометрическим методом на основные субпопуляции невозможно в виду близости их объемов, однако можно подобрать такую композицию растворителя и гемолитика, что различные формы лейкоцитов претерпевают изменения размеров в разной степени и, благодаря этому, могут разделяться данным методом. Изменение объема клетки зависит от многих факторов, включающих величину и форму ядра, объем цитоплазмы, наличие внутриклеточных включений и т.д., поэтому размер трансформированных клеток не соответствует размерам клеток при визуальном просмотре их в окрашенном мазке крови (таблица 1)

Таблица 1. Соотношение размеров клеток в окрашенных мазках крови и в приборах после обработки их лизирующим реагентом

+----------------------------+------------------+----------------+
¦         Тип клеток         ¦Размер клеток при ¦ Размер клеток  ¦
¦                            ¦визуальном анализе¦после обработки ¦
¦                            ¦   мазков крови   ¦    лизатом     ¦
+----------------------------+------------------+----------------+
¦Лимфоциты                   ¦малый             ¦малый           ¦
+----------------------------+------------------+----------------+
¦Базофилы                    ¦средний           ¦средний, малый  ¦
+----------------------------+------------------+----------------+
¦Эозинофилы                  ¦средний           ¦средний, большой¦
+----------------------------+------------------+----------------+
¦Моноциты                    ¦наибольший        ¦средний         ¦
+----------------------------+------------------+----------------+
¦Нейтрофилы                  ¦средний           ¦большой, средний¦
+----------------------------+------------------+----------------+
¦Патологические формы клеток ¦различный         ¦различный <*>   ¦
+----------------------------+------------------+----------------+
¦    <*> Дальнейшая идентификация патологических форм клеток     ¦
¦проводится визуально                                            ¦
L-----------------------------------------------------------------

Полученные после анализа лейкоциты распределяются на гистограмме следующим образом (рис. 12 - не приводится):

Область малых объемов (35 - 90 фл) формируется лимфоцитами, которые под действием гемолитика значительно уменьшаются в объеме.
Гранулоциты (нейтрофилы, базофилы и эозинофилы), напротив, подвергаются небольшому сжатию и расположены в области больших объемов (120-400 фл).
Между двумя пиками имеется зона так называемых "средних лейкоцитов" (90-120 фл), которая лучше всего коррелирует с моноцитами (по этой причине в некоторых анализаторах клетки в этой области указываются как моноциты). Однако, учитывая тот факт, что коэффициент корреляции с моноцитами R = 0,5 - 0,8 сравнительно невысок, более корректным является название параметра "средние лейкоциты" или "средние клетки" (MID). Практически в область средних клеток могут частично попадать базофилы, эозинофилы, различные патологические формы.

Высокотехнологические гематологические анализаторы [показать] .

Высокотехнологические гематологические анализаторы способны осуществлять дифференцированный счет лейкоцитов по 5-ти (5Diff) основным популяциям, используя различные принципы дифференцирования клеток: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты, оценивать наличие незрелых гранулоцитов, анализировать ретикулоциты и их субпопуляции, проводить оценку стволовых гемопоэтических клеток и субпопуляций лимфоцитов. Многочисленные функции современных гематологических анализаторов стали возможны, благодаря развитию новых технологий, которые отличаются у разных фирм-производителей.

Так, в анализаторах фирмы Bekman-Coulter (LH 500, LH750) (США - Франция) используется трехмерный анализ дифференцировки лейкоцитов (VCS-технология), который включает в себя одновременный компьютерный анализ клеток по объему (Volume) (рис. 13 - не приводится), электропроводности (Conductivity) (рис. 14 - не приводится) и дисперсии лазерного света (Scatter) (рис. 15 - не приводится).

Полученные по трем каналам данные с помощью электроники комбинируются и анализируются, в результате чего происходит распределение клеток по дифференцировочным кластерам и, таким образом, лейкоциты разделяются на пять основных популяций: лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы (рис. 16 - не приводится). Результатом отображения объемного графика на плоскости является лейкоцитарная скатерограмма, на которой каждый тип клеток имеет свою зону расположения.

В анализаторах серии Cell-Dyn для дифференцировки лейкоцитов применяется технология MAPSS - Multi Angle Polarized Scatter Separation - мультипараметрическая система лазерного светорассеивания - регистрация интенсивности рассеивания клетками поляризованного лазерного луча под разными углами. Этот метод заключается в компьютерном анализе дисперсии лазерного счета клетками крови (рис. 17 (а, б) - не приводится). Рассеивание клеткой поляризованного лазерного луча под разными углами дает сведения о таких ее свойствах, как:

размер клеток - для чего оценивается прохождение поляризованного лазерного луча под малым углом рассеивания (близким к 0°);
структура и степень сложности клеток - оценивается по анализу рассеивания поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до 7°;
ядерно-цитоплазматическое соотношение - оценивается по анализу рассеивания поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до 10°;
оценка формы клеточного ядра - осуществляется благодаря анализу светорассеивания поляризованных лазерных лучей под углом 90°;
для оценки клеточной зернистости и дифференцировки эозинофилов используется оценка светорассеивания деполяризованного луча под углом в 90°.

В приборах серии Technicon, ADVIA120, 2120, Pentra DX 120 разработан принцип жидкостной цитохимии (измерение активности пероксидазы в лейкоцитах), который в сочетании с другими методами (кондуктометрический, гидродинамическое фокусирование, оптическая абсорбция) позволяет проводить дифференцировку лейкоцитов. Использование пероксидазной реакции основано на различной ее активности в лейкоцитах. Так, эозинофилы и нейтрофилы имеют интенсивную пероксидазную активность, моноциты - слабую, в лимфоцитах она не выявляется.

Проточная цитохимическая техника включает регистрацию рассеянного и поглощенного светового луча. В лейкоцитарном канале после лизиса эритроцитов и стабилизации лейкоцитов происходит цитохимическая реакция, далее лейкоциты дифференцируются по двум признакам: размеру клеток, определяемому методом рассеивания лазерного луча, и пероксидазной активности - по поглощению клеткой светового потока (рис. 18 - не приводится). Дифференцировка базофилов от других гранулоцитов проводится в базоканале. Цитоплазма всех лейкоцитов за исключением базофилов подвергается лизису после обработки пробы специфическим лизатом. Затем в канале осуществляется измерение дисперсии лазерного света под углами 2°-3° и 5°-15°, что позволяет различить клетки в зависимости от формы ядер. (Рис. 19 - не приводится.)

Сравнивая информацию, получаемую с Perox- и Baso-каналов, компьютер осуществляет дифференцировку лейкоцитов на 5 основных популяций, а также сигнализирует в виде флагов о присутствии в крови активированных лимфоцитов, незрелых гранулоцитов, бластов, эритробластов.

В гематологических анализаторах серии XT и ХЕ фирмы Sysmex применяется метод проточной цитофлюориметрии с использованием флюоресцентного красителя полиметина. Этот флюоресцентный краситель связывается с ДНК и РНК неизмененных клеток, что позволяет использовать его как для дифференцировки лейкоцитов по 5-ти параметрам (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты), так и для подсчета ретикулоцитов (рис. 20 - не приводится).

Анализ клеток происходит в проточной кювете при пересечении луча лазера длиной 633 нм (рис. 21 - не приводится). После контакта лазерного луча с окрашенной клеткой происходит рассеивание последнего под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Данные сигналы улавливаются фотоумножителями и регистрируются в виде трех параметров (рис. 22 - не приводится):

Светорассеивание под малым углом (FSC) - отклонение лазерного луча под малым (до 10°) углом, которое зависит от размера (объема, только при условии сферической формы частицы) и формы клетки;
Боковое светорассеивание (SSC) - рассеивание под углом до 90° зависит от рефрактерного индекса (или плотности) клетки и характеризует сложность внутриклеточных структур;
Детекция специфического флюоресцентного сигнала (SFL), которая регистрируется также как боковое светорассеивание под углом 90° и позволяет судить о содержании РНК/ДНК в клетках.

На основании полученных сигналов все клетки распределяются по соответствующим кластерам (зонам) в соответствии с их размером, структурой и количеством ДНК (рис. 23 - не приводится). Таким образом, происходит дифференцировка лейкоцитов на 4 популяции: лимфоциты, моноциты, эозинофилы и нейтрофилы вместе с базофилами (рис. 24 - не приводится).

Разделение нейтрофилов и базофилов происходит в базоканале, где используется метод специфического химического лизиса, основанный на предварительной обработке лейкоцитов реактивом, осуществляющим лизис всех клеток, за исключением базофилов (рис. 25 - не приводится), с последующим дискриминантным анализом всех элементов по размеру и сложности структуры и количеству ДНК (рис. 26 - не приводится).

Кроме того, приборы оборудованы каналом для выделения незрелых гранулоцитов и атипичных лимфоцитов.

Таким образом, использование приборов с полным дифференцированным подсчетом лейкоцитов (5Diff) позволяет повысить точность дифференциального подсчета лейкоцитов, провести скрининг нормы и патологии, динамический контроль за лейкоцитарной формулой и резко сократить ручной подсчет лейкоцитарной формулы, оставляя примерно до 15 - 20% образцов крови для световой микроскопии.

Определение гемоглобина

В классическом гемиглобинцианидном методе (метод Драбкина) Fe⁺² гемоглобина окисляется до Fe⁺³ метгемоглобина феррицианидом, затем метгемоглобин переводится в стабильный цианметгемоглобин цианидом. Оптическая плотность CNmetHb измеряется при 540 нм, при которой имеется максимум поглощения. Гемиглобинцианидный метод рекомендован Международным комитетом по стандартизации в гематологии Всемирной Организации Здравоохранения и используется в мировой практике более 30 лет.

В гематологических анализаторах к методам определения гемоглобина предъявляется ряд специфических требований. Во-первых, время реакции должно быть в десятки раз меньше для обеспечения высокой производительности анализаторов. Во-вторых, для оптимизации конструкции анализаторов гемоглобин должен измеряться в том же гемолизате, который используется для подсчета лейкоцитов, и, следовательно, компоненты, обеспечивающие гемоглобиновую реакцию, не должны негативно влиять на подсчет лейкоцитов.

Многие гематологические анализаторы измеряют концентрацию гемоглобина модифицированным гемиглобинцианидным методом. Высокая скорость реакции достигается путем быстрого лизиса эритроцитов, денатурирования и окисления гемоглобина до Fe⁺³ с помощью поверхностно-активных веществ. Последующая реакция с цианидом формирует устойчивую форму со спектром поглощения, похожим на спектр гемиглобинцианида в методе Драбкина, и максимумом поглощения около 545 нм. Достоинством метода является его простота, высокая скорость реакции и стабильность конечного продукта. Применение циановых методов в гематологических автоанализаторах имеет два существенных недостатка, связанных с тем, что цианид из флаконов постепенно выпаривается в виде синильной кислоты. Во-первых, это может оказывать вредное воздействие на персонал при плохой вентиляции помещения. Во-вторых, это приводит к ухудшению реакции и изменению калибровки по гемоглобину через 2 - 3 месяца после подсоединения к прибору флакона с гемолитиком.

Учитывая недостатки модифицированных гемиглобинцианидных методов, в последние годы в большинстве новых моделей гематологических анализаторов используются бесциановые методы. Одной из первых бесциановый SLS (натрий лаурил сульфат)-метод использовала фирма Sysmex. Этот метод оказался не совместимым с определением лейкоцитов в одном канале, для его реализации используется дополнительный реагент и канал измерения.

В других современных бесциановых методах используются компоненты гемихромной реакции, которые совместимы с подсчетом лейкоцитов и их дифференциацией на три популяции. Высокая скорость реакции достигается путем быстрого лизиса эритроцитов, денатурирования и окисления гемоглобина до Fe⁺³ с помощью окислителей в присутствии поверхностно-активных веществ. При этом в качестве лигандов атомов железа гема используются отличные от цианида вещества.

Оптимальной областью фотометрирования является максимум спектральной кривой поглощения. Для гемиглобинцианида - это 540 нм (рис. 27 - не приводится), которая и есть рабочая длина волны для этого метода. Измерение в максимуме кривой, где смягчаются требования к точности установки длины волны, снижает требования к точности изготовления и стабильности оптических фильтров. Максимум кривой поглощения гемихрома находится на длине волны 533 нм. Однако измерение на этой длине волны возможно только в спектрофотометрах. В фотометрических ячейках гематологических анализаторов, как правило, применяются полосовые светофильтры с типовыми длинами волн. Ближайшая к 533 нм типовая длина волны 540 нм, на которой и проводится фотометрирование с учетом коэффициента пересчета для 540 нм. При переходе с цианового на бесциановый метод, как правило, требуется корректировка калибровки гемоглобина в пределах 0-5%.

Качество результатов исследования крови на гематологическом анализаторе определяется следующими факторами:

точностью дозирования цельной или разведенной крови;
точностью дозирования изотонического раствора при проведении процедуры разведения крови;
точностью определения объема суспензии, пропущенного через датчики подсчета клеток;
точностью самого подсчета клеток;
точностью определения размеров клеток;
корректностью математических методов обработки первичных результатов измерений.

Во избежание случаев несовместимости реагентов следует использовать изотонический раствор и гемолитик от одного изготовителя. При смене реагентов одного производителя на реагенты другого производителя необходимо проверить калибровку анализатора по контрольной крови, обращая особое внимание на Hb и MCV/HCT, и при необходимости нужно делать перекалибровку этих показателей. Калибровка других показателей, как правило, не меняется.

При эксплуатации гематологических анализаторов важную роль играет качество электрической сети и заземления. Внезапное отключение электропитания приводит к сбоям в работе приборов и необходимости вмешательства инженеров сервисной службы. В том случае, если электрическое питание пропадает в момент забора пробы или анализа и появляется спустя несколько часов (5-20 ч), последствия могут оказаться значительно более серьезными - может выйти из строя гидравлика, засориться сгустками крови капиллярные трубки, апертура и т.д. Поэтому прибор должен работать с источником бесперебойного питания, который должен обеспечить возможность окончания анализа и промывку прибора, т.е. работу прибора в течение нескольких минут.

Периодически необходима калибровка по стандартным материалам, так как электронные и механические компоненты прибора, датчиков, насосов и т.д. со временем подвергаются старению и меняют свои технические параметры. Для осуществления калибровки необходимо пользоваться только качественными контрольными материалами!

Важно! Гематологические анализаторы очень чувствительны к длительным отключениям и перебоям в работе, что связано с подсыханием шлангов, проростом микрофлоры, кристаллизацией из растворов. При длительной остановке (на период отпуска, переезда или отсутствия реагентов) обязательным является заполнение шлангов консервирующими растворами с последующей многократной отмывкой от них. Общее правило - не прерывать работу гематологического анализатора на длительный срок.

Автоматизированные гематологические анализаторы, поставляемые в КДЛ в рамках Приоритетного национального проекта "Здоровье"

Для оснащения клинико-диагностических лабораторий поликлиник предпочтение отдано автоматизированным гематологическим анализаторам, работа которых основана на кондуктометрическом методе, который позволяет получить до 18 параметров крови с определением трех популяций лейкоцитов (лимфоциты, клетки средних размеров, гранулоциты).

При использовании такого анализатора определяют:

Эритроцитарные параметры Тромбоцитарные параметры Лейкоцитарные параметры Гистограммы (распределение клеток по объему)

- RBC (количество эритроцитов)
- HGB (концентрация гемоглобина)
- НСТ (гематокрит)
- MCV (средний объем эритроцита)
- МСН (среднее содержание гемоглобина в эритроците)
- МСНС (средняя концентрация гемоглобина в эритроците)
- RDW (ширина распределения эритроцитов по объему) - PLT (количество тромбоцитов)
- MPV (средний объем тромбоцита)
- РСТ (тромбокрит)
- PDW (ширина распределения тромбоцитов по объему) - WBC (количество лейкоцитов)
- GR (гранулоциты, % и # - относительное и абсолютное количество)
- LY (лимфоциты, % и # - относительное и абсолютное количество)
- МО (моноциты, % и # - относительное и абсолютное количество) - Эритроцитарная
- Тромбоцитарная
- Лейкоцитарная

Автоматизированный гематологический анализатор MEK-6400J/K [показать] .

Прибор производства фирмы Nihon Kohden Corporation, Япония, определяет 18 параметров крови (рис. 28 - не приводится).

В приборе существует пять режимов разведения: нормальный, режим низкого, высокого и очень высокого разведения, режим предварительного разведения.

В нормальном режиме разведения измеряется образец объемом 30 мкл.

Для режимов измерения крови с предварительным разведением можно указать объем исследуемой крови (10 или 20 мкл). Этот режим удобен при работе с малым объемом крови, особенно у детей и пожилых людей.

При наличии лейкоцитоза образец крови может быть измерен в режиме высокого или более высокого разведения. В режиме высокого разведения образец крови объемом 10 мкл разводится втрое больше обычной пропорции разведения. В режиме более высокого разведения 5 мкл образца крови разводится в пропорции, в шесть раз большей обычной пропорции разведения.

В случаях низкого содержания в крови лейкоцитов и тромбоцитов образец измеряется в режиме низкого разведения, при котором 55 мкл крови разводится в пропорции, вдвое меньшей обычной пропорции. Пересчет с высоким/низким разведением недоступен для образцов в режиме предварительного разведения.

В анализаторе предусмотрено два типа автоматического пересчета клеток крови - при наличии сигналов тревоги ("флагов") и при тромбоцитопении. При этом автоматически производится двойной подсчет образца крови, выводятся и сохраняются средние значения исследуемых параметров. В случае серьезных отклонений (более 10%) между показаниями двух подсчетов автоматически выполняется третий и используется среднее значение двух самых близких по значениям подсчетов. При тромбоцитопении анализатор также автоматически производит пересчет образца, при этом пересчитываются также такие показатели, как RBC, НСТ, PLT, MCV, РСТ, МСН, МСНС и RDW. Оператор может самостоятельно установить порог, при котором происходит повторный счет клеток крови (например, 50,000/мкл, либо 100,000/мкл).

Прибор снабжен системой закодированных флагов, которые появляются на экране при наличии отклонений в измерении или изменении гистограмм распределения клеток. Следует внимательно изучить названия флагов, т.к. они помогают определить возможные причины их появления. Помимо количественных характеристик клеток крови в анализаторе отображается распределение клеток по объему в виде гистограмм, анализ которых имеет диагностическое значение.

Время исследования крови в закрытом режиме - примерно 90 сек./образец (от начала измерения до вывода данных), в открытом режиме - 60 сек.

Таблица 2. Технические характеристики гематологического анализатора МЕК-6400J/K

+--------------------------+--------------+----------------------+
¦   Измеренные параметры   ¦   Диапазон   ¦  Воспроизводимость   ¦
¦                          ¦   измерений  ¦образца венозной крови¦
¦                          ¦              ¦  (CV - коэффициент   ¦
¦                          ¦              ¦      вариации)       ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦WBC: количество лейкоцитов¦От 0 до 59 х  ¦CV до 2,0% (для WBC в ¦
¦                          ¦  3           ¦пределах 4,0 - 9,0 х  ¦
¦                          ¦10 /мкл <*>   ¦  3                   ¦
¦                          ¦              ¦10 /мкл)              ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦LY%: процентное содержание¦0 - 99,9%     ¦CV до 5,0% (для LY%   ¦
¦лимфоцитов                ¦              ¦в пределах 20 - 45%)  ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦МО%: процентное содержание¦0 - 99,9%     ¦CV до 12,0% (для МО%  ¦
¦моноцитов                 ¦              ¦в пределах 2 - 10%)   ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦GR%: процентное содержание¦0 - 99,9%     ¦CV до 5,0% (для GR%   ¦
¦гранулоцитов              ¦              ¦в пределах 40 - 70%)  ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦LY: число лимфоцитов      ¦От 0 до 59 х  ¦                      ¦
¦                          ¦  3           ¦                      ¦
¦                          ¦10 /мкл <*>   ¦                      ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦МО: число моноцитов       ¦От 0 до 59 х  ¦                      ¦
¦                          ¦  3           ¦                      ¦
¦                          ¦10 /мкл <*>   ¦                      ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦GR: число гранулоцитов    ¦От 0 до 59 х  ¦                      ¦
¦                          ¦  3           ¦                      ¦
¦                          ¦10 /мкл <*>   ¦                      ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦RBC: количество           ¦От 0 до 14,9 х¦CV < 1,5%             ¦
¦эритроцитов               ¦  6           ¦         6            ¦
¦                          ¦10 /мкл       ¦(5,0 х 10 /мкл)       ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦HGB: концентрация         ¦0 - 29,9 г/дл ¦CV < 1,5%             ¦
¦гемоглобина               ¦              ¦(HGB < 16 г/дл)       ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦НСТ: гематокрит           ¦0 - 99,9%     ¦                      ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦MCV: средний объем        ¦20 - 199 фл   ¦CV < 1,0% (MCV в      ¦
¦эритроцита                ¦              ¦пределах 70 - 120 фл) ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦МСН: среднее количество   ¦10 - 50 пг    ¦                      ¦
¦гемоглобина в эритроците  ¦              ¦                      ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦МСНС: средняя концентрация¦10 - 50 г/дл  ¦                      ¦
¦гемоглобина в эритроците  ¦              ¦                      ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦RDW: ширина распределения ¦0 - 50%       ¦                      ¦
¦эритроцитов по объему     ¦              ¦                      ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦PLT: количество           ¦0 - 1490 х    ¦CV < 4,0%             ¦
¦тромбоцитов               ¦  3           ¦               3      ¦
¦                          ¦10 /мкл       ¦(PLT > 3,0 x 10 /мкл) ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦РСТ: тромбокрит           ¦0 - 2,9%      ¦                      ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦MPV: средний объем        ¦0 - 20,0 фл   ¦                      ¦
¦тромбоцитов               ¦              ¦                      ¦
+--------------------------+--------------+----------------------+
¦PDW: ширина распределения ¦0 - 50%       ¦                      ¦
¦тромбоцитов по объему     ¦              ¦                      ¦
L--------------------------+--------------+-----------------------

<*> В случае пересчета при критическом значении: 0 - 599 х 10³/мкл.

Гематологический анализатор MEK-6400J/K сохраняет в памяти данные подсчета 400 образцов крови и гистограммы последних 50 образцов. Результаты гематологического исследования могут быть автоматически распечатаны на принтере или переданы на персональный компьютер. В анализаторе предлагается несколько автоматических программ контроля качества, полученные данные могут быть выведены и распечатаны в виде таблиц и графиков для каждого исследуемого параметра.

Гематологический анализатор ADVIA 60 [показать] .

Прибор, поставляемый фирмой BAYER, - автоматический гематологический анализатор с возможностью исследований цельной крови по 18 параметрам с производительностью до 60 проб в час (рис. 29 - не приводится). Прибор позволяет проводить дифференцирование популяции лейкоцитов по трем группам в процентном и абсолютном значениях.

Таблица 3. ТОЧНОСТЬ И ЛИНЕЙНОСТЬ ОСНОВНЫХ ИЗМЕРЯЕМЫХ ПАРАМЕТРОВ АНАЛИЗАТОРОМ ADVIA 60
Параметр	Точность (CV)	Диапазон линейности (с пределом отклонения)	Перенос пробы
WBC	< 2,5% при 10 x 10⁹/л	От 0,5 до 80 х 10⁹/л: 3%	< 0,5%
RBC	< 2% при 5 x 10¹²/л	От 0,2 до 7,5 х 10¹²/л: 2%	< 0,5%
НВ	< 1,5% при 15 г/дл	От 2,5 до 23 г/дл: 2%	< 0,5%
НСТ	< 2% при 45%	От 11,6 до 55%: 3%
PLT	< 5% при 300 x 10⁹/л	От 10 до 1,000 x 10⁹/л: 6%	< 0,5%
Лимфоциты	< 5% при 40%
Моноциты	< 10% при 10%
Гранулоциты	< 5% при 50%

Малый объем цельной крови, требуемый для анализа (10 мкл), делает прибор удобным для работы с детьми, так как позволяет провести процедуру отбора крови наименее травматично и наиболее точно с использованием капилляров и микропробирок с антикоагулянтом (ЭДТА).

Реагенты упакованы в герметичные пакеты с клапанами, объединенные в единый картридж (TimePac), что препятствует взаимодействию с атмосферным воздухом, защищает реагенты от повреждений и загрязнений, сохраняет стабильность (рис. 30 - не приводится). За один цикл измерения прибор выполняет до 3 подсчетов клеток для обеспечения необходимой точности исследования пробы. Прибор обеспечивает высокую стабильность калибровки до нескольких месяцев.

ADVIA 60 имеет возможность хранения данных калибровки, контроля качества исследований и результатов исследований крови пациентов. Распечатка результатов анализов с гистограммами и карты контроля качества производится на стандартном внешнем матричном принтере. Имеется возможность отображения флагов патологических образцов и ошибок счета, а также ввода и распечатки лабораторных норм.

Прибор ADVIA 60 долгое время присутствует на рынке лабораторного оборудования под маркой разных производителей, он зарекомендовал себя как надежный, простой в обращении и обслуживании анализатор, подходящий для разных клинико-диагностических лабораторий в качестве основного или дополнительного гематологического анализатора.

Гематологический анализатор COULTER Ас*Т [показать] .

Гематологический анализатор COULTER (R) Ас*Т diff™ (фирма Beckman Coulter, Франция) - надежная, простая в эксплуатации система, оптимальная для лабораторий с небольшим и средним объемом исследований.

Данная модель автоматического гематологического анализатора обеспечивает исследование крови по 18 параметрам, включая дифференцировку лейкоцитарной формулы по трем основным популяциям (лимфоциты, моноциты, гранулоциты) и получение гистограмм распределения по размерам клеток для эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов.

Рис. 31. Гематологический анализатор COULTER (R) Ас*Т diff™. Рисунок не приводится.

Применяемые технологии и методы исследования:

Метод Культера для подсчета и определения размеров клеток;
Трехкратный подсчет каждого образца;
Запатентованный метод "SWEEP FLOW" (уносящего потока) для предотвращения повторного счета клеток при анализе образца;
Непрерывный автоматический мониторинг состояния апертур;
Продленный по времени счет тромбоцитов в случае их низкой концентрации в образце.

Простое и удобное управление анализатором, использование интернациональных символов при выборе режимов исследования позволяют работать на данной системе операторам с разным уровнем подготовки. Автоматическая очистка иглы пробоотборника, система автоматической промывки, мониторинг состояния апертур, отсутствие необходимости в ежедневном обслуживании обеспечивают повышенную надежность работы системы и уровень безопасности для оператора, гарантируют точность получаемых результатов.

Система реагентов

Для анализатора предлагается полностью готовая к использованию система реагентов компании Beckman Coulter Inc.: diff Ac*T Pak (изотонический и лизирующий раствор) и Ас*Т RINSE (раствор для промывки системы). К набору реагентов diff Ac*T Pak прилагается специальная программная карта, которая используется при инициации новой упаковки реагентов и может быть использована для хранения контрольных данных.

Для мобильных лабораторий компания Beckman Coulter предлагает специальный набор реагентов diff Ac T Tainer, который включает все необходимые компоненты - изотонический, лизирующий и промывающий раствор.

Рис. 32. Реагенты для гематологического анализатора COULTER (R) Ас*Т diff™. Рисунок не приводится.

Для проведения контрольных испытаний компанией предлагаются два типа контрольных реагентов - 4С Plus Cell Control и 4С ES Cell Control.

Система управления данными

Автоматическое или ручное присвоение цифрового кода пациенту.
Три определяемых пользователем диапазона нормальных значений для анализа разных групп пациентов.
Хранение в памяти прибора результатов анализов до 250 образцов.
Хранение данных контроля качества по трем уровням контрольных образцов.

Графики Леви Дженнингса.

-----------------------------------------------------------------¬
¦Линейность                                                      ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦Параметры          Диапазон линейности               Ошибка     ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦                              3                                 ¦
¦WBC            0,0 - 99,9 x 10  клеток/мкл        +/- 0,3 или   ¦
¦                                                  +/- 5,0%      ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦                              6                                 ¦
¦RBC            0,0 - 7,00 x 10  клеток/мкл        +/- 0,05 или  ¦
¦                                                  +/- 5,0%      ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦Hgb            0,0 - 25,0 г/дл                    +/- 0,2 или   ¦
¦                                                  +/- 3,0%      ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦                             3                                  ¦
¦Plt            0,0 - 999 x 10  клеток/мкл         +/- 10 или    ¦
¦                                                  +/- 10,0%     ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦Указанный диапазон линейности сохраняется при использовании     ¦
¦стабилизированных образцов и отсутствии интерференции           ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦Точность                                                        ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦Параметры           Диапазон                   % CV             ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦                            3                                   ¦
¦WBC          6,0 - 15,0 х 10  клеток/мкл             < 3,0      ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦                             6                                  ¦
¦RBC          3,00 - 6,00 х 10  клеток/мкл      < 3,0            ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦Hgb          12,0 - 18,0 г/дл                        < 2,0      ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦MCV          80,0 - 100,0 фл                   < 3,0            ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦                           3                                    ¦
¦Plt          200 - 500 х 10  клеток/мкл              < 7,0      ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦MPV          5,0 - 20 фл                       < 3,0            ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦RDW          12,0 - 15,0%                      < 3,0            ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦LY           20 - 50%                                < 1,5 (S.D)¦
+----------------------------------------------------------------+
¦MO           2,0 - 10%                         < 1,5 (S.D)      ¦
+----------------------------------------------------------------+
¦GR           30,0 - 70,0%                      < 3,0 (S.D)      ¦
L-----------------------------------------------------------------

Представленные данные основаны на результатах 31 повтора одного образца.

Гемоглобинометр фотометрический портативный "МиниГЕМ" [показать] .

Гемоглобинометр МиниГЕМ 540 представляет собой специализированный фотометр, предназначенный для определения общего гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом с фотометрированием на длине волны 540 нм.

Рис. 33. Гемоглобинометр фотометрический портативный для измерения общего гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом АГФ-03/540-"МиниГЕМ", торговая марка "МиниГЕМ 540". Рисунок не приводится.

Диапазон измеряемой прибором оптической плотности составляет от 0 до 0,9 Б, что соответствует концентрации общего гемоглобина крови от 0 до 360 г/л. В приборе используется стандартная пробоподготовка - 20 микролитров крови, разведение 1:250. Суммарная погрешность определения гемоглобина (с учетом погрешностей дозаторов и погрешностей биохимического метода), полученная при сравнительных медицинских испытаниях, не превышает 2% (коэффициент вариации) во всем диапазоне измеряемых концентраций. При этом собственная погрешность гемоглобинометра как фотометра - не более 1%, а воспроизводимость, оцененная по коэффициенту вариации, - не более 0,25%.

Гемоглобинометр МиниГЕМ 540 является средством измерения медицинского назначения. Он проходит первичную поверку при выпуске с завода-производителя, которую производит Ростест-Москва. Поверка прибора в эксплуатации осуществляется по инструкции, утвержденной ВНИИОФИ в феврале 2005 года.

Главной отличительной особенностью гемоглобинометра МиниГЕМ 540 является то, что он не требует периодических калибровок, сохраняет заводскую калибровку неограниченно долго, в том числе при отключении питания.

Два фактора обеспечивают это качество прибора:

Высокая воспроизводимость характеристик раствора гемиглобинцианида, который сохраняет свои свойства при надлежащем хранении долгие годы, в том числе коэффициента пересчета оптической плотности в концентрацию гемоглобина (или фактора калибровки).
Конструкция гемоглобинометра МиниГЕМ 540 обеспечивает высокую надежность фотометрических параметров прибора. МиниГЕМ 540 снабжен функцией саморегулирования, он обладает многолетней стабильностью измерений.

Другая отличительная особенность гемоглобинометра - полностью автоматизированная процедура фотометрирования.

Для определения гемоглобина достаточно опустить кювету с фотометрической пробой в прибор, и через мгновенье на дисплее отобразится значение концентрации. Пересчет оптической плотности раствора в концентрацию производится автоматически. Перед измерением прибор не нужно включать, "прогревать", подстраивать или калибровать. Гемоглобинометр автоматически выключится при вынимании кюветы до следующего измерения.

Третья особенность гемоглобинометра МиниГЕМ 540 - его портативность и низкое энергопотребление.

Корпус прибора, выполненный из светлого химически стойкого пластика, имеет размеры 178 х 128 х 43 мм. Масса прибора без батарей не превышает 300 граммов. Питание от сети через адаптер или от встроенных батарей. Ресурс батарей - 1000000 измерений или 4 года работы.

Для контроля работоспособности гемоглобинометра используется контрольная стеклянная мера, паспортизованная для каждого прибора.

Внутрилабораторный и внешний контроль качества может проводиться с помощью обычных контрольных материалов - контрольных растворов гемоглобина.

Методика измерений:

Подготовить пробирки, поместив в каждую из них по 5 мл трансформирующего раствора (раствор Драбкина).
Во время взятия крови в каждую пробирку перенести по 20 мкл капиллярной крови и тщательно перемешать раствор.
Через 20 минут (время лизирования) провести серию измерений. Для этого:
- перелить в оптическую кювету реакционную смесь из очередной пробирки;
- опустить оптическую кювету в фотометрическую ячейку прибора, при этом автоматически произойдет фотометрирование реакционной смеси, сопровождаемое звуковым сигналом, и на индикаторе появится число, соответствующее концентрации гемоглобина.
Записать результат измерения.

Гематологические анализаторы. Интерпретация анализа крови. Методические рекомендации от 21 марта 2007 г. N 2050-РХ

Преаналитический этап гематологических исследований

Автоматизированное исследование клеток крови

Основные параметры автоматизированного анализа крови и факторы, влияющие на их значения

Интерпретация результатов автоматизированного гематологического анализа

Контроль качества на гематологических анализаторах

Основная литература [показать]

Долгов В.В., Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е. // Лабораторная диагностика анемий. Тверь, Губернская медицина, 2001.
Козинец Г.И., Макаров В.А. (Ред.) // Исследование системы крови в клинической практике. М., Триада-Х, 1997.
Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А. и др. // Клетки крови - современные технологии их анализа. М, "Триада-Фарм", 2002, с. 4 - 27.
Г.И. Козинец, В.М. Погорелов, О.А. Дягилева, И.Н. Наумова. // Кровь. Клинический анализ. Диагностика анемий и лейкозов. Интерпретация результатов. М., Медицина XXI, 2006.
Меньшиков В.В. (Ред.) Клиническая лабораторная аналитика. // М., т. 2, 1999.
Кузнецова Ю.В., Ковригина Е.С., Байдун Л.В. и др. // Использование эритроцитарных индексов и показателей обмена железа в дифференциальной диагностике микроцитарных анемий. Гематол. и трансфузиол., 2000, т. 45, N 6, с. 46 - 48.
Луговская С.А., Почтарь М.Е. // Гематологический атлас. М., "Триада", 2004.
Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е., Долгов В.В. // Лабораторная гематология. М., "Триада", 2006.
Луговская С.А., Почтарь М.Е. // Ретикулоциты. М., 2006.
Матер. XIX Международного симпозиума "Technological Innovations in Laboratory Hematology", April 25 - 28, 2006.
Новик А.А., Богданов А.Н.. Анемии. СПб, "Нева", 2004.
Погорелов В.М., Козинец Г.И., Ковалева Л.Г. // Лабораторно-клиническая диагностика анемий, МИА, 2004.
Шиффман Ф.Д. // Патофизиология крови. М. - СПб., 2000.
Briggs С., Rogers R., Thompson В., Machin S. // "New Red Cell Parameters as Potential Markers of Functional Iron Deficiency". Infusion Therapy and Transfusion Medicine, 2001, v. 28, N 5, p. 249 - 308.
Hillman R.S., Ault K.A., Rinder H.M. // Hematology in Clinical Practice, McGrawHill, 2005.
Hinsmann R. // "Iron Metabolism, Iron Deficiency and Anemia". Sysmex Journal International, 2003, v. 13, N 2, p. 65 - 74.
Pollard Y., Watts M.J., Grant D. et al. // Use of the haemopoietic progenitor cell count of the SYSMEX SE-9500 to refine apheresis timing of peripheral blood stem cells. Br. J. Haematol, 1999, v. 106, p. 538 - 544.
Peng L., Jang J. Jang H. et al. // Determination peripheral stem cells by the SYSMEX SE-9500. Clin Lab Haemat., 2001, v. 23, p. 231 - 236.
Thomas L., Franck S., Thomas C., Messinger M. // "Clinical Utility of RET-Y in Functional Iron Deficiency. Proceedings of the Sysmex European Symposium", 2003, p. 91 - 101.
Torres Gomez A., Casano J., Sanchez J. at al. // "Utility of reticulocyte maturation parameters in the differential diagnosis of macrocytic anemias". Clin. Lab. Haematology, 2003, v. 25, p. 283 - 288.
Yu J., Leisenring W., Fritschle W. et al. // Enumeration of HPC in mobilized peripheral blood with the SYSMEX SE-9500 predicts final CD34+ cell yield in the apheresis collection. Bone Marrow Transplantant, 2000, v. 25, p. 1157 - 1164.
Wintrobe M.M. // Clinical Hematology - 9-th-Ed. Lea and Febiger, 1993.
Wang F.-S., Morikawa Т., Biwa S. et al. // Monitoring Heamatopoietic Stem and Progenitor Cells with SYSMEX Automated Haematology Analysers. Lab. Hemat., 2002, v. 8, p. 119 - 125.