Процесс свертывания крови строго контролируется присутствующими в плазме и активируемыми в ходе свертывания белками-ингибиторами, которые ограничивают выраженность протеолитических реакций и обеспечивают защиту от нежелательного тромбообразования [1,2,3]. Главными ингибиторами факторов свертывания крови являются серпины: антитромбин III (АТ III), гепариновый кофактор II (ГК II), С1-ингибитор; ингибитор пути тканевого фактора типа Кюница; α₂-макро-глобулин и система протеина С.

Основную долю ингибиторной (антикоагулянтной) активности плазмы определяет АТ III [1, 3, 4], который в разной степени ингибирует почти все ферменты коагуляционного каскада: тромбин, факторы IХа, Ха, ХIа и ХПа. Свободные тромбин и фактор Ха являются основными мишенями АТ III. АТ III нейтрализует сериновые протеазы посредством ковалентного связывания; в результате формируется неактивный стехиометрический комплекс между ферментом и ингибитором путем образования связи аргинин-содержащего активного центра АТ III и активного серинового центра протеазы. При этом фермент утрачивает способность расщеплять любые субстраты, т. к. АТ III закрывает доступ для субстратов к активному центру фермента. Ингибирующая способность АТ III в присутствии гепарина может возрастать в 1000-3000 раз [2, 5].

Дефицит АТ III значительно увеличивает вероятность развития тромбоза. Он может быть наследственным или приобретенным. Недостаток АТ III часто появляется при заболеваниях печени, ДВС-синдроме, сепсисе, тромбоэмболии легочной артерии, нефротическом синдроме, инсульте, тромбозе глубоких вен [1].

Поскольку АТ III является основным естественным ингибитором системы гемостаза и его количественная или функциональная недостаточность часто приводит к развитию тромбозов, задача мониторинга и контроля функциональной активности данного белка представляется крайне важной. Большинство методов, которые используют клинико-диагностические лаборатории в своей практике для определения активности АТ III, основаны на его способности инактивировать тромбин в присутствии гепарина. В этих методах уровень функционального АТ III определяется с помощью хромогенного субстрата. Хромогенный метод основан на том, что протеаза, остающаяся после нейтрализации АТ III, отщепляет хромофор (р-нитроаналин) от субстрата, который затем может быть измерен фотометрически [10]. Метод является чувствительным, точным и легко воспроизводимым в условиях рутинных клинических исследований по гемостазу.

Относительно недавно было доказано, что метод определения активности АТ III, основанный на способности плазмы инактивировать фактор Ха в присутствии гепарина, является более точным, специфичным и стабильным по сравнению с традиционным методом, в основе которого лежит способность АТ III инактивировать тромбин. Новый метод позволяет исключить интерференцию ГК II, который является специфичным ингибитором тромбина, на реальную активность АТ III в исследуемой плазме [6, 7, 9]. Вклад ГК II в процесс ингибирования тромбина может быть у ряда пациентов весьма существенным, поскольку скорость ингибирования данным кофактором сравнима со скоростью ингибирования протеазы АТ III [5]. Это влияние ГК II полностью отсутствует при использовании фактора Ха вместо тромбина.

В работе С. Demers и соавт. [6] проведен сравнительный анализ результатов определения активности АТ III традиционным методом по измерению остаточной активности тромбина и методом измерения остаточной активности фактора Ха (АТ III-фХа). Обследована группа пациентов (всего 67 чел.) с врожденным дефицитом АТ III. Контроль наличия или отсутствия дефицита АТ III осуществлялся методом ДНК-диагностики. Показано, что у 16% пациентов врожденный дефицит АТ III традиционным методом выявлен не был, в то время как при использовании метода АТ III-фХа дефицит АТ III диагностирован у всех обследуемых. Полученные результаты показывают, что традиционный метод может "пропускать" пациентов с реальным дефицитом АТ III, т. е. давать ложнонормальные результаты.

В другом исследовании [8] авторы уделили большое внимание изучению вопроса о достоверности результатов метода измерения остаточной активности АТ III с использованием тромбина. Была исследована активность АТ III в 27 образцах плазмы пациентов с приобретенным дефицитом АТ III с добавлением лепирудина (рекомбинантный гирудин - прямой ингибитор тромбина, обладающий уникальной способностью напрямую связываться с активным тромбином и блокировать его биологическое действие), в дефицитной по АТ III плазме и в смеси АТ III-дефицитной плазмы с нормальной плазмой. Также активность АТ III была определена в образцах плазмы здоровых доноров, пациентов с врожденным и приобретенным дефицитом АТ III и пациентов, получающих гепариновую терапию.

Было показано, что при использовании терапевтической концентрации лепирудина активность АТ III была заметно завышена при измерении традиционным методом по сравнению с использованием метода АТ III-фХа. Остаточная активность АТ III в дефицитной по АТ III плазме, определенная методом, основанным на использовании тромбина, была существенно выше в сравнении со значением, полученным с использованием метода АТ III-фХа. Традиционный метод также дал завышенные результаты и в образцах плазмы пациентов, получающих гепариновую терапию. На основе полученных данных авторы работы делают вывод, что функционально активный АТ III наиболее достоверно может измеряться хромогенным методом с использованием фактора Ха во всех вариантах исследований. "Тромбиновый" метод также не может использоваться для пациентов, получающих терапию гирудином или другим прямым ингибитором тромбина.

Завышение значений активности АТ III у пациентов, получающих гепариновую терапию, при измерении методом с использованием тромбина подтверждают и данные авторов другой работы, в которой подробно рассматривался вопрос о выявлении возможных причин подобного завышения [7]. Был проведен детальный клинико-биохимический анализ возможностей методов определения АТ III, основанных на использовании тромбина и фактора Ха. Для 460 образцов плазмы пациентов, не получающих гепариновой терапии, совпадение результатов было достаточно хорошим, однако "тромбиновый" метод все же давал слегка завышенные результаты - до 3% активности АТ III. Несоответствие, однако, оказалось существенным для образцов, уровень гепарина в которых составлял 0,8 ± 1,2 ед/мл. Анализ данных, полученных для образцов 102 пациентов, показал, что традиционный метод в среднем на 7-16% завышает реальные значения активности АТ III по сравнению с методом АТ III-фХа. Иммунологические исследования (добавление антител к АТ III и ГКII) показали, что эти различия целиком связаны с влиянием активности ГК II в "тромбиновом" методе. Результаты исследования показывают, что данные, полученные методом с использованием фактора Ха, более объективно отражают активность АТ III у пациентов, получавших лечение гепарином.

Аналогичные исследования проводились японскими специалистами, изучавшими влияние ГК II на активность АТ III, измеренную "тромбиновым" методом и методом с использованием фактора Ха на плазме беременных женщин [9]. Активность плазменного АТ III у беременных женщин на поздних сроках была значительно выше, чем у небеременных контрольных доноров, при использовании "тромбинового" метода по сравнению с использованием метода АТ III-фХа. Эти результаты показывают, что активность АТ III, измеренная "тромбиновым" методом, была завышена у беременных женщин благодаря перекрестной активности ГК II. Авторами рекомендовано измерение активности АТ III методом с использованием АТ III-фХа.

Таким образом, данные многих исследователей показывают, что использование наборов реактивов для определения активности АТ III, основанных на инактивации тромбина в присутствии гепарина, приводит к получению лабораторией ложнозавышенных значений данного показателя, особенно у пациентов, получающих гирудин или любые другие прямые ингибиторы тромбина. Все это может привести к получению врачами-клиницистами необъективных результатов определения активности АТ III и выбору неправильной тактики лечения пациентов.

АТ III - гликопротеин, наиболее важный естественный ингибитор свертывания крови; ингибирует тромбин и ряд активированных факторов свертывания (Ха, ХIIа, IХа). Он образует с гепарином быстродействующий комплекс - гепарин-АТ III. Снижение уровня АТ III является фактором тромбогенного риска (снижение уровня АТ III до 50-60% ведет к значительному повышению частоты тромбозов). Низкое содержание АТ III делает неэффективной терапию гепарином: ослабление действия гепарина наблюдается при снижении содержания АТ III до 50%, при снижении до 20% действие гепарина почти полностью прекращается. В связи с этим получение завышенных значений активности АТ III при использовании "тромбинового" метода может обусловить существенный риск для пациента. Использование же метода с ингибированием фактора Ха позволяет получать надежные и точные результаты.

Врачу клинической лабораторной диагностики необходимо использовать данную информацию при выборе наборов реактивов для определения активности АТIII в своей повседневной практике.

Список использованной литературы

1. Балуда В.П., Балуда М.В., Деянов И.И., Тлепшуков И.Л. Физиология системы гемостаза / Под ред. проф. Балуды В.П. М., 1995.
2. Карвалъхо А.К. Гемостаз и тромбоз. В кн.: Шиффман Ф. Дж. Патофизиология крови. М.: Binom Publishers, 2000.
3. FriedbergR. C., Hagen P. O., Pizzo S. V. The role of endothelium in factor Xa regulation: the effect of plasma proteinase inhibitors and hirudin // Blood. 1988. V. 71 (5). P. 1321-1328.
4. Ена Я.М., Плапгонова Т.Н., Сушко Е.А., Шевчук Т.Е. Антитромбин III: функциональная характеристика и клиническое значение // Биохимия. 1993. № 6. С. 9-18.
5. Панченко Е.П., Добровольский А.Б. Тромбозы в кардиологии. М., 1999.
6. Demers C., Henderson P., Blajchman M.A. et al. An antithrombin III assay based on factor Xa inhibition provides a more reliable test to identify congenital antithrombin III deficiency than an assay based on thrombin inhibition // Thromb. Haemost. 1993. V. 69 (3). P. 231-235.
7. Bohner ]., von Pape KW., Blaurock M. Thrombin-based antithrombin assays show overestimation of antithrombin III activity in patients on heparin therapy due to heparin cofactor II influence // Thromb. Haemost. 1994. V. 71 (3). P. 280-283.
8. Beeck H., Nagel D., Pindur G. et al. Measurement of antithrombin activity by thrombin-based and by factor Xa-based chromogenic substrate assays // Blood Coagul. Fibrinolysis. 2000. V. 11 (2). P. 127-135.
9. Akai Y., Shiga S., Tohyama K. et al. Effect of heparin cofactor II on the antithrombin III activities measured by thrombin methods or factor Xa methods - fundamental studies and clinical studies using the plasma of pregnant women // Rinsho Byori. 2000. V. 48 (9). P. 867-938.
10. Goodnight S.H. Jr., Schaeffer J.L., Sheth K. Measurement of antithrombin III in normal and pathologic states using chromogenic substrate S-2238. Comparison with immunoelectrophoretic and factor Xa inhibition assays // Am. J. Clin. Pathol. 1980. V. 73 (5). P. 639-686.