Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с. Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление "Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий"	Содержание
	ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации	Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом ЛИТЕРАТУРА [показать] Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305. Георгиев Г.П. Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm). Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х., Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 169-175. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С. Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. "Итоги науки и техники" ВИНИТИ, серия "Морфология". – 1991. – вып. 15. – 115 с. Франк Г.А. Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом "Династия", 2004. – 88 с. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P. 200-202. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p. De Miguel M.P., Royuela M., Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P. 1131-1139. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P. 801-807. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P. 205-262. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M., Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry. John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml). Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M. Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204. ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ

Опухоли мезенхимального происхождения представляют один из наиболее сложных разделов онкоморфологии. Это связано с большим числом нозологических форм и их вариантов, обусловленных многообразием гисто- и морфогенеза, сложностями дифференциального диагноза при наличии весьма близкой структурной и клеточной характеристики опухоли, разнообразием клинического течения и прогноза (Франк Г.А., 2004).

При идентификации опухолей мягких тканей используется большое количество иммуногистохимических маркеров, наиболее часто встречающимися из них являются следующие.

Виментин – это один из белков промежуточных филаментов, являющихся главными структурными белками клетки. Только виментин представлен в мезенхимальных клетках во время раннего эмбрионального развития и, как правило, как только клетка подвергается дифференцировке, заменяется типовыми специфическими промежуточными филаментами. Несмотря на то, что виментин раньше считали специфическим маркером мезенхимальной дифференцировки клеток, этот белок был найден в различных немезенхимальных опухолях, включая аденокарциномы яичников, щитовидной железы, эндометрия, почек, молочной железы, надпочечников и легких, а также меланомы, мезотелиомы и лимфомы.

Цитокератин – главный компонент цитоскелета эпителиальных клеток. Антитела, направленные против цитокератина, являются самыми частыми иммунореагентами при определении эпителиальной дифференцировки. Некоторые из мезенхимальных опухолей обладают способностью экспрессировать кератин, наиболее часто СК8 и СК18. К ним относятся: синовиальная саркома, мезотелиома, десмопластическая мелко-круглоклеточная опухоль, хондрома, парахордома, меланотическая нейроэктодермальная опухоль и внепочечная рабдоидная опухоль.

ЕМА (эпителиальный мембранный антиген) – гликопротеин, присутствующий на плазматической мембране эпителиальных клеток. ЕМА, наподобие цитокератинов, обнаруживается в различных видах нормального эпителия и развивающихся из него опухолях. Характерная локализация – на клеточной поверхности или на внутрицитоплазматических мембранах. Антиген был также обнаружен в плазматических клетках, в крупноклеточных лимфомах, особенно в анапластической крупноклеточной лимфоме с транслокацией t(2;5).

ЕМА-экспрессия в мезенхимальных опухолях по большей части аналогична цитокератинам, за исключением нескольких характерных особенностей. Антитела к ЕМА более чувствительны при установлении эпителиальной дифференцировки в низкодифференцированных случаях монофазной синовиальной саркомы

Актины – сократительные белки, являющиеся главными компонентами системы микрофиламентов клетки. Выявлено шесть основных изоформ актина.

Антитела к альфа-актину гладких мышц являются надежными маркерами для определения гладкомышечных опухолей. SMA и α-SMA также окрашивают клетки с частичной гладкомышечной дифференцировкой: перициты, миоэпителиальные клетки и миофибробласты. Определение перицитов вокруг сосудистых структур – признак доброкачественного сосудистого процесса, тогда как в большинстве злокачественных сосудистых новообразований число перицитарных клеток снижено.

Десмин – промежуточный филамент, найденный в сердце, скелетных и гладких мышечных волокнах. В скелетных мышечных клетках нити десмина вплетаются в Z-диски, в гладкомышечных клетках связывают веретенообразные плотные пятна, которые идут параллельно нитям актина. Антитела к десмину являются хорошим маркером для определения гладко- и скелетномышечной дифференцировки; чаще этот маркер экспрессируется в рабдомиосаркоме, чем в лейомиосаркоме. Наличие десмина также обнаруживается в ангиомиофибробластоме вульвы, где главными неопластическими элементами могут быть измененные миофибробластоподобные клетки.

Миозины в мышечных клетках действуют как ферменты и структурные белки. Они имеют способность связывать актиновые нити в мышцах и инициируют мышечное сокращение. Миозины могут быть разделены на гладкий и поперечно-полосатый мышечные типы. Поперечно-полосатый тип миозина (скелетный и сердечный мышечные миозины) называют саркомерным миозином. Антитела к нему нашли применение в диагностике рабдомиосаркомы.

Антиген, связанный с фактором VIII, также известный как фактор фон Виллебранда, является большим мультимерным компонентом комплекса фактора VIII системы свертывания крови. Синтезируется эндотелиальными клетками, мегакариоцитами и тромбоцитами, а также во внутриклеточных органеллах клеток эндотелия – тельцах Weibel-Palade. Антитела к фактору VIII часто рассматриваются в качестве специфических маркеров эндотелиальной дифференцировки, но не являются достаточно чувствительными, так как не окрашивают эндотелий капилляров в различных органах и дают слабую окраску лимфатического эндотелия.

CD30 экспрессируется в клетках Рида-Штейнберга при болезни Ходжкина, на поверхности активированных В- и Т-клеточных лимфоцитов, а также в эмбриональных злокачественных клетках.

CD31 – гликопротеин, который принадлежит к молекулам клеточной адгезии семейства иммуноглобулинов, известный также как молекула адгезии.

PECAM-I (эндотелиальная молекула адгезии тромбоцитов), представлен на тромбоцитах, гранулоцитах и клетках эндотелия. Ранее считалось, что этот белок менее специфичен для эндотелия, чем фактор VIII. Однако CD31 оказался более чувствительным маркером злокачественных сосудистых опухолей в связи с его способностью иммуноокрашивать низкодифференцированные очаги в ангиосаркомах и веретеноклеточные поля саркомы Капоши. В случаях мезотелиомы и некоторых аденокарцином может выявляться слабое цитоплазматическое окрашивание на белок CD31. При этом отсутствует специфический мембранозный тип экспрессии, характерный для клеток эндотелия.

CD34 – гликозилированная трансмембранная молекула адгезии клеток, которая встречается на гемопоэтических клетках-предшественниках, эндотелиальных клетках сосудов и субпопуляции фибробластоподобных клеток в пределах соединительной ткани. Способность экспрессировать данный белок теряют зрелые клетки или подвергающиеся дальнейшей дифференцировке. Как маркер эндотелия CD34 окрашивает внутрицитоплазматические пространства неопластических клеток, составляющих эпителиоидную гемангиоэндотелиому, и показывает большую чувствительность, сопоставимую с CD31, чем фактор VIII, особенно при определении низкодифференцированных ангиосарком, веретенообразных участков саркомы Капоши.

Энолаза – это гликолитический фермент. Различные изоформы энолазы состоят из гомодимеров альфа-, бета- и гамма-субъединиц и встречаются практически во всех тканях тела человека. Гамма-энолаза или нейронспецифическая энолаза (NSE) находится в высоких концентрациях в клетках нервной системы и нейроэндокринных клетках. Первоначально NSE рассматривался как специфический маркер нейроэндокринной дифференцировки, однако экспрессия данного белка была обнаружена в нейроэндокринной карциноме, нейробластоме, параганглиоме и феохромоцитоме. Последние исследования показали, что NSE иммунореактивность для нейроэндокринных клеток менее специфична, так как была определена в тканях не нервного происхождения, различных не эндокринных карциномах, в нескольких вариантах сарком: рабдомиосаркоме, лейомиосаркоме, ангиомиосаркоме, синовиальной саркоме, светлоклеточной саркоме и альвеолярной мягкотканой саркоме, а также в меланоме и лимфоме. Другие мезенхимальные опухоли, которые экспрессируют NSE, – это саркома Юинга (примитивная нейроэктодермальная опухоль), десмопластическая мелко-круглоклеточная опухоль, гастроинтестинальная стромальная опухоль и мезенхимальная хондросаркома. В настоящее время доступен ряд более специфичных маркеров нервной ткани.

Белок S-100 относится к группе небольших кальцийсвязывающих белков, которые участвуют в клеточном цикле, клеточной дифференцировке, в процессах взаимодействия цитоскелета с мембраной. Данный белок экспрессируется шванновскими клетками периферической нервной системы, гистиоцитами с антиген-презентирующей функцией типа клеток Лангерганса, адипоцитами, хондроцитами, меланоцитами, миоэпителиальными клетками, клетками мозгового вещества надпочечников. С диагностической точки зрения, белок S-100 рассматривается как чувствительный, но не специфичный маркер периневрия и меланоцитов и поэтому должен быть использован в панели с другими иммунореагентами. Сильная и диффузная ядерная или цитоплазматическая экспрессия белка S-100 типична для нейролеммомы (доброкачественная и клеточная шваннома) и более вариабельна в нейрофиброме.

Как маркер опухолей меланоцитарного происхождения антитела к белку S-100 окрашивают практически все доброкачественные меланоцитарные процессы, исключая некоторые голубые невусы, а также меланомы, включая десмопластический вариант. Белок S-100 (наряду с цитокератинами) можно использовать в диагностике хордомы. S-100 иммунореактивность обнаруживается в большей части хорошо дифференцированных хондроидных опухолей; для внескелетной миксоидной хондросаркомы характерна низкая или отрицательная реакция. Ограниченная экспрессия данного белка в определенных субпопуляциях гистиоцитов используется при подтверждении диагноза гистиоцитоза Лангерганса и заболевания Розаи-Дорфмана, развивающегося в мягких тканях. Иммунореактивность белка S-100 также отмечена в миоэпителиоме мягких тканей, парахордоме и в приблизительно 30% синовиальных сарком.

Антитела к HMB-45 реагируют с антигенами, которые ассоциируются с ранними стадиями образования меланосомы. Несмотря на то, что антитела к HMB-45 окрашивают эмбриональные меланоциты и соединительнотканные невусы, включая соединительнотканный компонент сложного невуса, они не дают реакции со зрелыми меланоцитами или внутридермальными невусами. Отмечено, что данные антитела являются специфичными и чувствительными для меланомы и могут использоваться вместе с S-100.

Ген MIC2 локализуется в псевдоаутосомных участках X и Y хромосом и кодирует гликопротеин – CD99 (или антиген E2), который экспрессируется на поверхностных мембранах некоторых лимфоцитов, T-лимфоцитов коркового вещества тимуса, клетках зернистого слоя фолликулов яичников. Антиген также экспрессируется большинством клеток панкреатических островков, клеток Сертоли яичек и некоторыми эндотелиальными клетками. Наибольшее диагностическое значение CD99 имеет при дифференциальной диагностики примитивной нейроэктодермальной опухоли – саркомы Юинга от низкодифференцированной нейробластомы, в которой, несмотря на значительное морфологическое сходство, реакция с CD99 не наблюдается. CD-экспрессия характерна не только для саркомы Юинга, но также обнаружена в опухолях из малых клеток голубого невуса, при острой лимфобластной Т-клеточной лимфоме, рабдомиосаркоме, опухоли Вильямса, мелкоклеточной остеосаркоме и других опухолях.

C-kit кодирует трансмембранный рецептор тирозинкиназного фактора роста (KIT, CD117), который найден в гематопоэтических "стволовых" клетках, тучных клетках, зародышевых клетках, меланоцитах, интерстициальных клетках Кахала желудочно-кишечного тракта и некоторых эпителиальных клетках. CD117 не выявляется в лейомиомах; обычно он обнаруживаются в гастроинтестинальных стромальных опухолях. CD117 также экспрессируется в большинстве опухолей из тучных клеток, обнаружен в некоторых гранулоцитарных саркомах.

При определении нозологических форм опухолей мезенхимального происхождения первоначально приходится основываться на гистологическом строении опухолевых клеток, а затем иммуногистохимически ставить точный диагноз. В подобных случаях полезно использовать следующую панель. При преобладании в опухоли веретеновидных клеток следует использовать следующие маркеры: гладкомышечный актин (SMA), десмин, белок S-100, цитокератины, CD34, эпителиальный мембранный антиген.

Опухоли с плеоморфной клеточной структурой исследуют на: цитокератины, белок S-100, актин, десмин, CD30.

При эпителиоидном строении опухолевых клеток применяют следующие маркеры: цитокератины, белок S-100, CD34.

Опухоли преимущественно круглоклеточного строения исследуют на: цитокератины, общий лейкоцитарный антиген, десмин и/или myf-4, CD99, белок S-100.

Таким образом, большинство мезотелиальных опухолей можно идентифицировать с помощью нескольких специфических иммуногистохимических маркеров:

• для лейомиосаркомы характерна экспрессия гладкомышечного актина и десмина;
• синовиальная саркома выявляется эпителиальным мембранным антигеном (ЭМА) и цитокератинами;
• для злокачественной шванномы характерен белок S-100;
• рабдомиосаркома экспрессирует десмин, саркомерный актин, миоглобин;
• саркома Юинга – CD99, нейронспецифическую энолазу;
• ангиосаркома – CD31, CD34, фактор Виллебранда;
• эпителиоидная саркома – эпителиальный мембранный антиген, цитокератины;
• светлоклеточная саркома – белок S-100, HMB-45.