Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с. Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление "Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий"	Содержание
	ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации	Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом ЛИТЕРАТУРА [показать] Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305. Георгиев Г.П. Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm). Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х., Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 169-175. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С. Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. "Итоги науки и техники" ВИНИТИ, серия "Морфология". – 1991. – вып. 15. – 115 с. Франк Г.А. Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом "Династия", 2004. – 88 с. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P. 200-202. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p. De Miguel M.P., Royuela M., Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P. 1131-1139. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P. 801-807. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P. 205-262. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M., Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry. John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml). Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M. Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204. ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ

Подготовка клеток и тканей

Выявление антигенов в клетках и тканях с помощью иммуногистохимии осуществляется в несколько этапов. Исследуемые образцы замораживаются или заключаются в парафин, режутся на микротоме и помещаются на предметные стекла. Затем срезы освобождаются от парафина, на них проводят демаскирование антигенов, блокируют неспецифическое связывание белков и эндогенную пероксидазную активность и затем проводят инкубацию с первичными антителами. Связавшиеся первичные антитела выявляют, добавляя вторичные антитела, конъюгированные при помощи полимера с пероксидазой хрена, и осуществляют визуализацию вторичных антител при помощи субстрата – диаминобензидина. После достижения максимальной интенсивности окрашивания, срезы промывают водой для прекращения реакции, докрашивают гематоксилином и заключают в заливочную среду.

Для ИГХ пригоден практически любой материал: цитологические мазки, свежезамороженная или фиксированная ткань. Выбор исследуемого материала должен определяться свойствами изучаемого антигена: так, большинство цитоплазматических антигенов выявляются на фиксированных формальдегидом и залитых в парафин срезах; поверхностные клеточные антигены, как правило, разрушаются или маскируются при обычной фиксации и могут быть выявлены только на свежезамороженных тканях либо в культуре клеток.

Фиксация

Основная часть гистологических и цитологических методик направлена на сохранение морфологической структуры клеток и тканей, для этого исследуемые образцы помещают в фиксирующие растворы. Фиксация необходима для предотвращения аутолиза антигенов; при этом блокируются лизосомные ферменты и предотвращается рост бактерий, которые вызывают разрушение клеточной структуры.

Положительный результат иммуногистохимической реакции во многом определяется адекватной фиксацией исследуемых антигенов в тканях. Выявляемый антиген должен быть нерастворимым в жидкостях за счет процесса фиксации его к тканевым компонентам. Особенностью антигена является доступность его первичной структуры для антител. С другой стороны, за счет денатурации белков, фиксация вызывает структурные изменения и инактивацию антигенного профиля клеток. Идеальный фиксатор должен сохранять морфологию исследуемого материала, закреплять исследуемый антиген в месте его распределения и не нарушать его антигенные свойства. До настоящего времени подобного фиксатора не описано.

Выбор специфического фиксатора для отдельных компонентов клетки имеет большое значение. Из этих компонентов важную роль играют белки клетки, а лучшим для них фиксатором является формалин; в тех случаях, когда формалин использовать нельзя, его обычно заменяют спиртом или ацетоном. В частности, антигены промежуточных филаментов лучше выявлять на свежезамороженных срезах или тканях, фиксированных в спиртах.

Фиксация мазков крови и цитологических препаратов. Перед фиксацией препараты высушивают 1-2 часа при комнатной температуре для предотвращения повреждения клеток. При высушивании клетки плотно прилипают к стеклу и не смываются при последующей фиксации. Высушивание не повреждает структуры поверхностных антигенов лейкоцитов. Мазки фиксируют либо в абсолютном ацетоне, либо в 96° этаноле 1-3 мин, с последующей окраской клеток.

Приготовление срезов тканей

Иммуногистохимия на криостатных срезах. Криостатные срезы подходят для выявления большинства антигенов. Срезы толщиной 5 мкм помещают на покрытые поли-L-лизином стекла и высушивают в течение 12 часов при комнатной температуре. Срезы фиксируют, погружая в холодный ацетон -20 °С, либо другой фиксатор (этиловый спирт, формалин и т.п.) на 2 мин. Стекла высушивают на воздухе и проводят регидратацию в 1% неиммунной бычьей сыворотке в солевом фосфатном буфере (PBS), затем осуществляют иммуногистохимическую реакцию.

Иммуногистохимия на парафиновых срезах. Современные методы демаскирования клеточных антигенов позволяют проводить ИГХ реакции на парафиновых срезах. При этом в качестве фиксатора может быть использован 10% раствор забуференного формальдегида.

Заливка в парафин:

1. Фиксация в забуференном формалине – сутки.
2. Промывка в проточной воде – 2 часа.
3. 70% этанол – 30 мин.
4. 80% этанол – 30 мин.
5. 90% этанол – 30 мин.
6. 100% этанол – 3 смены по 1 часу.
7. Ксилол/ этанол 1:1 – 15 мин.
8. Ксилол – 2 смены по 30 мин.
9. Ксилол/ парафин 1:1 при 56?С – 30 мин.
10. Парафин – 2 смены при 56?С 1 час.
11. Заливка.

Перед проведением ИГХ реакции на парафиновых срезах необходимо осуществить их регидратацию. Срезы толщиной 4-5 мкм режутся на покрытые поли-L-лизином стекла, затем высушиваются при 37?С в течение ночи и 1 час при 60 °С.

Регидратация:

1. Ксилол – 3 смены по 5 мин.
2. 100% этанол – 2 смены по 3 мин.
3. 96% этанол – 2 смены по 3 мин.
4. 80% этанол – 3 мин.
5. Дистиллированная вода – 2 смены по 3 мин.

Демаскирование антигенов

После фиксации в формалине и заливки в парафин тканевые антигены необходимо демаскировать. Эта процедура направлена на восстановление оригинальной структуры белка. Методы демаскирования антигенов, такие как обработка протеолитическими ферментами или нагревание в микроволновой печи после формалиновой фиксации и заключения в парафин способствуют обнаружению не выявляемых ранее антигенов.

Демаскирование клеточных антигенов ферментами (трипсин, протеиназа К, проназа) применяется, как правило, для цитокератинов и некоторых других клеточных антигенов. Другой способ «освобождения» антигенов осуществляется путем нагревания, при этом отмечается усиление иммуногистохимической реакции на срезах, фиксированных в формалине. Для нагревания можно использовать как водяную баню, так и микроволновую печь. Как правило, нагревание срезов проводят в 10 мМ цитратном буфере при рН 6,0.

Протокол обработки срезов ферментами:

1. Поместить срезы в дистиллированную воду.
2. Приготовить 0,1% раствор трипсина или протеиназы К в PBS (рН 7,6).
3. Инкубировать при 37 °С от 15 до 60 мин.
4. Остановить действие фермента ополаскиванием в холодной воде.
5. Перенести в PBS.

Протокол обработки срезов в микроволновой печи:

1. Поместить срезы в пластиковый контейнер с 10 мМ цитратным буфером (pH 6,0).
2. Нагревать срезы при мощности 700 Вт 7 мин.
3. Долить испарившуюся жидкость и нагревать срезы при мощности 350 Вт 20 мин.
4. Остудить срезы вне печи в течение 15 мин.
5. Перенести срезы в PBS.

Блокировка эндогенной активности ферментов

Эндогенная активность пероксидазы. Пероксидазная активность встречается во многих клетках организма: эритроцитах (гемоглобин), миоцитах (миоглобин), макрофагах и нейтрофилах (цитохромы), гепатоцитах и эпителии почек (каталаза). Для нейтрализации эндогенной пероксидазной активности на срезы на 10 мин наносят 1-3% раствор перекиси водорода.

Эндогенная активность щелочной фосфатазы. Блокирование щелочной фосфатазы осуществляют 5 мМ раствором левамизоля.

Биотин. Витамин Н – биотин – присутствует в печени, почках и др. органах. При использовании по время ИГХ реакции пероксидазно-авидинового комплекса для визуализации меченых биотином вторичных антител, возможно его неспецифическое связывание с клеточными компонентами, содержащими эндогенный биотин. Для предотвращения подобной неспецифической реакции перед осуществлением блокирования эндогенной пероксидазы проводят инкубацию срезов в 0,1% р-ре авидина, а затем в 0,01% растворе биотина в Трис-буфере (ТБС). Второй способ избежать неспецифической реакции с биотином – это использование современных безбиотиновых систем визуализации антигенов.

Проведение иммуногистохимической реакции

Существует множество различных методов иммуноферментной окраски, которые позволяют определить место локализации антигена: прямой метод, непрямые методы, методы с использованием ферментных иммунных комплексов, авидин-биотиновые методы и др.

Прямой метод. Эта методика была разработана A.H. Coons, M.H. Kaplan (1950). Меченые ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианатом) первичные антитела наносили непосредственно на срезы. После инкубации несвязанные антитела смывали фосфатным буфером и с помощью ультрафиолетового света выявляли места локализации антигенов по зеленоватой флюоресценции.

Непрямой метод. Был также описан A.H. Coons с соавт. (1955). Этот метод более чувствителен, чем прямой, т.е. то же количество первичных антител, присоединенных к тканевым антигенам, будет более интенсивно окрашиваться по сравнению с прямым методом либо то же количество антигенов можно локализовать за счет более низкой концентрации первичных антител. Первичные немеченые антитела наносят на срезы, а их избыток смывается буфером. Затем наносятся вторичные конъюгированные с ФИТЦ антитела, принадлежащие другому виду животных, полученные к гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови животных, использовавшихся в качестве первичных антител. В этом случае первичные антитела, связавшиеся с антигенами исследуемой ткани являются антигенами для меченых вторичных антител, которые также распределяются в месте локализации тканевых антигенов. Другим преимуществом непрямого метода является возможность применения одних и тех же меченых вторичных антител, при использовании первичных антител от одного и того же вида животных. Маркеры для этого метода могут быть флуоресцентными (флуоресцин, родамин), ферментными (пероксидаза хрена), а также коллоидное золото.

Не конъюгированный антигенно-ферментный метод. Название связано с тем, что как первичные, так и вторичные антитела не конъюгируются с маркерами. В свою очередь, вторичные антитела используются как мостик между первичными антителами и конечными, которые также не конъюгируются, а получаются путем иммунизации животных того же вида, что и первичные антитела к пероксидазе хрена. За последним слоем антител наносится пероксидаза хрена, которая присоединяется путем реакции антиген-антитело и затем проявляется гистохимически. За счет отсутствия химической конъюгации, не повреждается иммунологическая реактивность всех антител.

Одиночный мост. Первым слоем может быть кроличья сыворотка, полученная против первичного антигена, второй слой – неконъюгированная сыворотка козы против кроличьих гаммаглобулинов и третий слой – кроличья сыворотка, полученная против пероксидазы хрена, которая затем проявляется гистохимическим методом, таким как диаминобензидин и перекись водорода по R.C. Graham и M.J. Karnovsky (1966).

Двойной мост. Он включает повторение второго слоя, сыворотки козы против кроличьих иммуноглобулинов после кроличьей антипероксидазной сыворотки и затем повторение кроличьей антипероксидазной сыворотки перед нанесением пероксидазы и её визуализацией, таким образом достигается увеличение числа мест, связывающих пероксидазу.

Пероксидазно-антипероксидазный метод. Развитие этого метода L.A. Sternberger (1979) оказало большое влияние на иммуногистохимию. Модификация Штейнбергом мостовой методики заключалась в проведении реакции антипероксидазных антител с пероксидазой перед нанесением их на ткани. Эта реакция приводила к образованию стабильного комплекса трех молекул пероксидазы хрена с двумя молекулами антител. Этот комплекс отделялся от непрореагировавших антител и пероксидазы перед использованием. Он реагирует как антиген третьего слоя. Первый слой составляют кроличьи антитела, реагирующие с тканевыми антигенами, второй слой образует неконъюгированная вторичная сыворотка козы против кроличьих антител в избытке, таким образом одно из парных соединительных мест антител (Fab-часть) является свободной для реагирования с третьим слоем кроличьего ПАП комплекса. Таким образом, обеспечивается высокое соотношение между количеством пероксидазного маркера и первичным антигеном. Кроличьи ПАП молекулы реагируют только с антикроличьими иммуноглобулинами козы второго слоя, и это обеспечивает отсутствие неспецифического связывания с тканью. Это специфичная и свободная от фона реакция. Для увеличения интенсивности, нанесение второго и третьего слоев можно повторить.

Авидин-биотиновый метод. Два новых вещества стали использовались в иммуногистохимии после исследований J.L. Guesdon с соавт. (1979) – биотин и авидин. Биотин (витамин Н) в большом количестве содержится в белках птичьих яиц, где он связан с большим гликопротеидом – авидином. Авидин имеет высокую аффинность к биотину, одна его молекула может присоединить 4 молекулы биотина. Биотин может связываться с Fc-иммуноглобулинами, каждая молекула биотина имеет одно место связывания, но с одной молекулой иммуноглобулина могут связываться несколько молекул биотина. Как биотин, так и авидин могут быть помечены флуоресцентной меткой, ферментом, ферритином или молекулой золота. Методика с использованием авидин-биотиновых комплексов считается соответствующей либо даже превышающей ПАП метод по чувствительности. В этой методике первый слой представляют первичные кроличьи антитела; второй слой составляют биотинилированные антикроличьи иммуноглобулины козы; третий слой представлен авидин-биотиновым комплексом. Авидин реагирует с биотинилированной пероксидазой хрена в такой пропорции, при которой три связывающих места авидина взаимодействуют с биотинилированной пероксидазой, оставшееся одно место на каждой молекуле является свободным для взаимодействия с биотином второго слоя антител. Метод блокирования неспецифического взаимодействия с тканевым биотином был предложен G.S. Wood и R. Warnke (1981). Неконъюгированный авидин наносится на ткани для связывания биотина и затем добавляется в избытке неконъюгированный биотин для предупреждения любого связывания авидин-биотинового комплекса.

В последнее время различными фирмами разработаны новые методы визуализации иммуногистохимической реакции с использованием конъюгатов полимеров. К длинной молекуле полимера присоединяется большое количество фермента. За счет увеличения концентрации фермента повышается чувствительность метода. При этом с полимером могут быть конъюгированы как первичные антитела, так и молекулы фермента EPOS (Enhanced Polymer One Stepstaining) фирмы Dako. Если с молекулой полимера конъюгируются вторичные антитела и фермент (EnVision, фирмы Dako), то иммуногистохимическая реакция проводится в два этапа, при этом достигается высокая чувствительность по сравнению с другими методами визуализации.

Наибольшую популярность в настоящее время получили иммуногистохимические методики, использующие для визуализации реакции ферменты пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу, с использованием стрептовидинбиотинового комплекса. Эта методика проводится в три этапа: нанесение неокрашенных первичных антител, затем биотинилированных вторичных антител и добавление связанного с молекулами фермента стрептовидина (Dabbs D.J., 2002). Необходимо отметить, что чувствительность ИГХ методики во многом зависит от используемых реагентов и особенностей проведения реакции, в связи с чем, сложно сравнивать результаты ИГХ при использовании различных реактивов и методических приемов.

Важными условиями проведения иммуногистохимической реакции является подбор титра антител. Титром антител называют максимальное разведение сыворотки, при котором наблюдается выраженное специфическое окрашивание без неспецифического фонового окрашивания окружающих тканей. Все коммерческие антитела имеют инструкции с описанием оптимального разведения, однако часто подбирать титр антител приходится экспериментально, поскольку этот показатель зависит от таких причин, как длительность инкубации первичной сыворотки, окружающая температура, выбранная система визуализации распределения первичных антител и т.п.

Перед нанесением первичных антител срезы помещают на 1-2 мин в PBS, затем необходимо удалить избыток буфера вокруг среза и капнуть на срез небольшое количество первичной сыворотки от 30 до 50 мкл в зависимости от площади среза. Затем срезы помещают горизонтально во влажную герметичную камеру на подставку, под которой находится фильтровальная бумага, смоченная водой, для предотвращения неспецифического связывания антител с тканью за счет их высыхания. И проводят инкубацию при комнатной температуре в течение 15-30 мин в зависимости от рекомендаций производителя антител. Для ускорения процессов связывания антител с антигенами можно проводить инкубацию при температуре 37?С. Для повышения интенсивности ИГХ реакции и увеличения разведения используемой сыворотки можно проводить реакцию при 4 °С в холодильнике в течение ночи.

Протокол иммуногистохимической реакции, предлагаемый компанией Dako.

1. Приготовить парафиновые срезы на стеклах, покрытых поли-L-лизином, провести депарафинирование и регидратацию в TBS (Dako TBS, S196830, добавить 0,05% Tween 20).
2. Удалить избыток жидкости вокруг срезов и капнуть 1% р-р перекиси водорода 10 мин.
3. Промыть в TBS.
4. Удалить избыток жидкости вокруг срезов.
5. Нанести первичные антитела (мышиные или кроличьи). Инкубировать 30 мин при комнатной температуре во влажной камере.
6. Промыть в TBS.
7. Удалить избыток жидкости вокруг срезов.
8. Нанести вторичные антитела (смесь антимышиных или антикроличьих биотинилированных антител). Инкубировать 15-30 мин при комнатной температуре во влажной камере.
9. Промыть в TBS.
10. Удалить избыток жидкости вокруг срезов.
11. Нанести конъюгированный с пероксидазой стрептавидин. Инкубировать 15-30 мин при комнатной температуре во влажной камере.
12. Промыть в TBS.
13. Удалить избыток жидкости вокруг срезов.
14. Провести гистохимическое выявление пероксидазной активности с раствором диаминобензидина 5-10 мин.
15. Промыть в воде.
16. Докрасить ядра гематоксилином Майера 1-2 мин.
17. Промыть срезы в проточной воде.
18. Провести дегидратацию в восходящей батареи спиртов.
19. Заключить срезы в канадский бальзам.