Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с. Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление "Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий"	Содержание
	ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации	Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом ЛИТЕРАТУРА [показать] Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305. Георгиев Г.П. Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm). Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х., Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 169-175. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С. Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. "Итоги науки и техники" ВИНИТИ, серия "Морфология". – 1991. – вып. 15. – 115 с. Франк Г.А. Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом "Династия", 2004. – 88 с. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P. 200-202. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p. De Miguel M.P., Royuela M., Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P. 1131-1139. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P. 801-807. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P. 205-262. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M., Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry. John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml). Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M. Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204. ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ

При использовании различных методов визуализации антигенов должно получиться интенсивное четко выявляемое окрашивание тканевых антигенов в исследуемом образце и позитивном контроле. Окрашивание негативного контроля также необходимо принимать во внимание при оценке специфичного расположения исследуемых антигенов. Интерпретация полученных результатов ИГХ реакции включает такие термины, как "выраженная позитивная реакция", "ложно-позитивная реакция", "негативная реакция", "ложно-негативное окрашивание".

Негативную реакцию сложно интерпретировать, в отличие от позитивной, для этого необходимо провести контрольные исследования с различными дополнительными антителами. Так, при выявлении гистогенеза недифференцированной злокачественной опухоли на предмет рак это или лимфома, отрицательной реакции с антителами на кератин (промежуточный филамент, выявляемый в большинстве раков) недостаточно для постановки диагноза лимфомы. Необходимо провести дополнительное исследование и получить положительное окрашивание опухолевых клеток на общий лимфоцитарный антиген (белок, характерный для большинства лимфом).

Контроль иммуногистохимической реакции

При любом иммуногистохимическом исследовании необходимо использовать различные контрольные тесты для оценки адекватности методической процедуры. Для подобных процедур исследуют стекла с тканью положительного и негативного контроля для того, чтобы убедиться в том, что 1) система визуализации работает адекватно, 2) положительное или негативное окрашивание является специфичным, 3) полностью соблюдена методическая последовательность.

Контроль ИГХ реакции означает оценку специфичности взаимодействия антител с тканевыми антигенами. С этой целью используют отрицательный и положительный контроль.

Отрицательный контроль.

• Для отрицательного контроля берут срезы тканей, в которых заведомо нет искомого антигена. Результаты реакции должны быть отрицательными.
• При проведении ИГХ реакции исключают инкубацию с первичными антителами, заменяя их неиммунной сывороткой. Результаты реакции должны быть отрицательными.
• Антитела (в максимальном разведении) предварительно адсорбируют специфическим антигеном (0,1-10 нмоль/ мл), затем их наносят на срезы в качестве контроля. Результаты реакции должны быть отрицательными. После адсорбции специфическим антигеном антитела должны терять способность окрашивать ткань. Подобный контроль необходимо ставить с каждой новой антисывороткой и при обнаружении новых участков взаимодействия антител с тканью.

Положительный контроль.

В любом опыте важно иметь положительный контроль – окрашивать ткань, заведомо содержащую исследуемые антигены, для того чтобы убедиться, что все антитела работают нормально. В качестве положительного контроля служат срезы тканей, в которых исследуемый антиген заведомо присутствует. Результаты реакции должны быть положительными.

Возможные проблемы, возникающие при проведении ИГХ реакции

Если наблюдается сильное фоновое окрашивание, то необходимо:

• до нанесения первичных антител провести блокирование нормальной сывороткой животного, донора вторичных антител, либо использовать готовые антитела для блокирования мест неспецифического связывания антител, значительно снижающие фоновую неспецифическую окраску срезов;
• использовать более высокие разведения первичных и/или вторичных антител. В результате разведения абсолютное количество загрязненных антител падает, в то время как количество специфических антител остается достаточным для визуализации антигенов;
• возможно, во время инкубации с сыворотками срезы подсохли;
• уменьшить время инкубирования первичных антител;
• снизить температуру при инкубации первичных антител;
• уменьшить время инкубации субстрата;
• более тщательно промывать срезы после инкубации с антителами;
• провести адсорбцию первичных и вторичных антител альбумином. Неспецифическое связывание иммуноглобулинов с компонентами ткани за счет гидрофобных или электростатических взаимодействий можно предотвратить путем адсорбции антисыворотки альбуминами животного, ткань которого предстоит окрашивать. При этом блокируются большинство участков неспецифического связывания, но образующиеся связи слабее, чем связь антигенантитело и не мешают взаимодействовать специфическим антителам с антигеном. К рабочему раствору антител можно также добавить нормальную сыворотку до концентрации 1%;
• внести в буфер, используемый для промывки, детергент (0,2% тритон Х-100) для снижения неспецифического связывания белка;
• попытаться дополнительно заблокировать эндогенную пероксидазу например 3% или 6% раствором перекиси водорода, нитроферрицианидом натрия или смесью периодат-борогидрид;
• ткани обладают эндогенной биотиновой активностью. Необходимо провести блокирование эндогенной биотиновой активности, используя авидин-биотин блокирующие реагенты до нанесения первичных антител;
• антитела и исследуемая ткань принадлежат к одному виду животных. Мышиные антитела используются для выявления антигенов в тканях мыши;
• удалить комплемент из препарата первичных антител, прогревая антисыворотку 30 мин при 56 °C.

Возможные причины слабого окрашивания всех срезов:

• неадекватная фиксация ткани. Необходимо сделать криостатные срезы замороженной нефиксированной ткани, фиксировать их в различных фиксаторах, затем проводить ИГХ реакцию;
• ошибки при осуществлении демаскирования антигенов;
• антиген был разрушен до инкубации с первичной сывороткой. Следует провести блокирование эндогенной пероксидазной активности после проведения реакции с первичными антителами;
• низкая концентрация первичных или вторичных антител. Для подбора оптимальной концентрации антител необходимо провести пробную ИГХ реакцию с их различными разведениями;
• ошибки или пропуск одной из процедур иммунохимического окрашивания. Возможно использование вторичных антител, которые специфически не взаимодействуют с первичными. Если используются первичные мышиные антитела, необходимо применить вторичные антимышиные антитела;
• слишком короткое время инкубации с первичными антителами;
• слишком низкая температура при инкубации с первичными антителами;
• старый субстрат. Свежий субстрат как правило представляет светло розовый раствор, появление коричневой окраски свидетельствует о том, что субстрат – старый;
• слишком интенсивное смывание реагентов буфером привело к разведению реагентов;
• несовместимость реагентов докрашивания или заключения срезов с продуктами реакции;
• неполная депарафинизация срезов. Необходимо продлить время депарафинизации срезов, либо заменить ксилол;
• антитела не работают из-за неправильного их хранения. Хранить антитела желательно в замороженном состоянии в небольших объемах при температуре минус 20 °C – минус 70 °C, избегая повторного замораживания и оттаивания антител.

Причины окрашивания только срезов с положительным контролем, в то время как исследуемая ткань не окрасилась, могут быть следующие:

• в исследуемой ткани нет искомого антигена или его концентрация незначительна. Необходимо увеличить время инкубации первичных антител;
• неадекватная обработка исследуемой ткани, вызвавшая денатурацию исследуемых антигенов;
• образцы слишком долго фиксировались в формалине. В результате произошло маскирование антигена за счет кросс-связывания альдегидов и увеличения гидрофобности ткани. Возможно, для демаскирования антигена необходимо провести дополнительное нагревание срезов в микроволновой печи или обработку ферментом;
• иммунореактивность уменьшилась или повредилась во время обработки тканей при высокой температуре. Не следует нагревать образцы выше 60 °C.

Срезы слетают с предметных стекол:

• исключить детергенты из буфера для промывания срезов;
• прогреть парафиновые срезы в термостате в течение 2 суток при температуре 37 °C;
• нарушена морфология исследуемой ткани;
• плохая фиксация ткани;
• ткань повреждена из-за высокой концентрации или длительной обработкой детергентами (Triton X-100).