Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с. Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление "Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий"	Содержание
	ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации	Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом ЛИТЕРАТУРА [показать] Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305. Георгиев Г.П. Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm). Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х., Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 169-175. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С. Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. "Итоги науки и техники" ВИНИТИ, серия "Морфология". – 1991. – вып. 15. – 115 с. Франк Г.А. Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом "Династия", 2004. – 88 с. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P. 200-202. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p. De Miguel M.P., Royuela M., Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P. 1131-1139. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P. 801-807. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P. 205-262. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M., Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry. John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml). Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M. Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204. ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ

Первыми клеточными маркерами, исследование которых стало использоваться в практической медицине, были рецепторы к стероидным гормонам – эстрогенам (РЭ) и прогестерону (РП). Их изучение проводилось у больных раком молочной железы и результаты учитывались при назначении терапии.

Рецепторы стероидных гормонов представляют собой белки, специфически и избирательно связывающие соответствующие стероиды, после их проникновения в клетку и опосредующие их биологические эффекты. Присутствие РЭ в первичной опухоли молочной железы свидетельствует о ее потенциальной чувствительности к лечебным мероприятиям, направленным на противодействие эффектам эстрогенов. Считается, что наличие в опухоли рецепторов к эстрогенам (РЭ) и рецепторов к прогестерону (РП) свидетельствует о ее чувствительности к экзогенным гормонам и является прогностически благоприятным фактором. РП синтезируются в клетке под влиянием эстрогенов и, следовательно, являются показателем функциональной активности РЭ.

Содержание рецепторов эстрогена и прогестерона всегда выше в высокодифференцированных опухолях, а также у больных, находящихся в постменопаузе, по сравнению с женщинами репродуктивного и пременопаузального возраста. Известно, что при отсутствии гормонорецепторов в опухоли прогноз менее благоприятен и риск возникновения рецидивов выше. Показано, что в рецептор-негативных опухолях пролиферация опухолевых клеток в 10 раз активнее. В рецептор-положительных опухолях эстрогены тоже стимулируют процессы пролиферации, однако они не достигают уровня, свойственного рецептор-негативным опухолям.

Известно, что гормонозависимые опухоли молочной железы, содержащие оба или хотя бы один из рецепторов, имеют более благоприятное течение и лучший прогноз, независимо от проводимого адъювантного лечения, чем больные с рецептор-отрицательными опухолями. В.Ф. Семиглазов с соавт. (2001) установили, что опухоли, содержащие более 10% окрашенных на рецепторы к эстрогенам или прогестерону клеток, оказываются чувствительными к гормонотерапии. Больные, у которых опухоль не содержит рецепторов к стероидным гормонам, только в 5-10% случаев отвечают на гормональную терапию. У этих пациентов можно получить более выраженный лечебный эффект от цитостатической терапии.

Прогностическое значение рецепторного статуса опухоли отражает влияние эстрогенов на характер и течение заболевания. Известно, что РЭ(+)- опухоли обладают меньшей склонностью к прогрессированию, чем РЭ(-)- опухоли, но этот факт отчетливо проявляется лишь в первые годы наблюдения и заметно сглаживается к 10-летнему сроку.

Определение рецепторов к стероидным гормонам также важно для выбора тактики лечения и оценки эффективности проводимой гормонотерапии. Чувствительность опухоли к гормонам определяется сохранением в опухоли рецепторов, способных воспринять гормональный сигнал и транслоцировать его в ядро. Есть сведения о существовании различных форм рецепторов к эстрогенам и прогестерону: РЭ-альфа, РЭ-бета, РП-А и РП-B. Оба вида РЭ обладают практически одинаковым сродством к эстрадиолу. С присутствием РЭ-альфа в опухолях молочной железы связана чувствительность к тамоксифену. Рецепторы прогестерона, представленные изоформами А и В, играют различные роли в проникновении стероидов внутрь клетки. При наличии в опухоли рецепторов двух видов (РЭ и РП) эффективность метода гормонотерапии составляет 50–70%. Если присутствуют только рецепторы одного вида (РЭ или РП), то эффективность снижается до 33–39%.

Половые гормоны играют важную роль и в этиологии рака предстательной железы (ПЖ). Функциональная активность предстательной железы взрослого мужчины зависит от уровня тестостерона в крови. Андрогены необходимы для нормального роста и функциональной активности ПЖ человека. Андрогены, действуя через андрогеновые рецепторы (АР), играют важную роль в развитии рака предстательной железы (РПЖ). Существуют доказательства, что усиленная трансактивационная активность АР может быть связана с риском развития РПЖ. Андрогены выступают как опухолевые промоторы через АР-связанный механизм, который ведет к усилению клеточной пролиферации и уменьшению апоптоза.

Клиническая стадия заболевания, степень анапластических изменений опухолевых клеток, объем опухоли и уровень ПСА в сыворотке крови являются традиционными маркерами, позволяющими судить о прогрессии РПЖ. Однако они не всегда информативны и не дают надежной оценки эффективности лечения у конкретного пациента. В течение последних лет интенсивно изучаются молекулярные маркеры, участвующие в генетических процессах онкогенеза при РПЖ: мутации, амплификации или другие повреждения соответствующих генов или экспрессия их белков. Поскольку андрогены действуют через АР, уровень их экспрессии при первичном РПЖ может иметь прогностическое значение при назначении гормональной терапии.

В нормальной ПЖ взрослого человека белок АР экспрессируется в основном в ядрах эпителия и стромальных клетках. Имеются иммуногистохимические работы по изучению АР при ДГПЖ и РПЖ, в большинстве из них выявлена ядерная экспрессия АР. АР экспрессировались во всех первичных опухолях и метастазах в лимфатические узлы и кости. В РПЖ окрашивание клеток на АР является гетерогенным со значительным снижением АР-позитивных клеток в менее дифференцированных опухолях, что свидетельствует об их невысокой чувствительности к антиандрогеновой терапии.

Обнаружено, что иммуногистохимическое определение экспрессии АР является надежным показателем для прогноза эффективности антиандрогеновой терапии, поскольку экспрессия АР значительно ниже при РПЖ по сравнению с неопухолевой тканью. Многофакторный анализ выявил достоверную корреляцию между прогрессией и уровнем АР и пролиферативной активностью клеток.

В настоящее время доказано, что развитие РПЖ зависит от уровня андрогенов в организме, однако опухоли нередко прогрессируют до андрогеннезависимых, и это приводит к низкой эффективности гормональной антиандрогеновой терапии и последующей смерти пациентов. В связи с этим фактом ИГХ окрашивание опухолей ПЖ на андрогеновые рецепторы может быть полезным индикатором течения заболевания, подобно тому, как изучаются рецепторы к эстрогенам при раке молочной железы. В настоящее время показано, что андроген-независимость первичной опухоли ПЖ является достоверным признаком плохого прогноза у пациентов. Можно ожидать, что потеря опухолевыми клетками экспрессии АР будет сопровождаться потерей регуляции со стороны андрогенной сигнальной системы и развитием резистентности к антиандрогеновой терапии.

Рецепторы факторов роста. Рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР) – это трансмембранный гликопротеин, после активации которого под действием внутриклеточных тирозиновых киназ происходит деление клетки. Он экспрессируется при раке желудка, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря и многих других эпителиальных опухолях. Количественные исследования показали, что экспрессия РЭФР в опухолевых клетках более выражена, чем в неизмененном эпителии. При раке желудка экспрессия РЭФР пропорциональна глубине инвазии и характеризует низкую выживаемость пациентов. В нормальном уротелии эти рецепторы располагаются вдоль базальной мембраны, тогда как при переходноклеточном раке определяются во всех его слоях. При этом установлено, что обнаружение РЭФР при раке мочевого пузыря является прогностически неблагоприятным признаком, в связи с тем, что наличие этого маркера связано со стадией, степенью дифференцировки и плоидностью опухолевых клеток.

Четыре сходных по структуре трансмембранных рецептора РЭФР (ЕrbB-1), HER-2/neu (ЕrbB-2), HER-3 (ЕrbB-3), HER-4 (ЕrbB-4), принадлежащих к семейству тирозинкиназных рецепторов (продуктов онкогенов C-erbB), представляют одну из важнейших систем передачи митотического сигнала.

Рецепторы семейства ЕrbB могут образовывать как гомо-, так и гетеродимеры, при этом во многих случаях наиболее активными являются гетероструктуры с участками не имеющего собственного лиганда рецептора HER-2/neu. Этот рецептор – уникальный представитель семейства трансмембранных тирозинкиназ, поскольку не имея собственного лиганда и не взаимодействуя ни с одним из известных факторов роста, активизирующих родственные рецепторы, является ключевым звеном передачи митотических сигналов всех ЭФР-подобных пептидов и необходим для усиленного функционирования всей системы. Перспектива практического использования маркеров, связанных с РЭФР-зависимой регуляцией роста рака молочной железы появилась после внедрения препарата герцептина, представляющего собой гуманизированные антитела к HER-2/neu, как одному из рецепторов семейства ЕrbB, к которому принадлежит и РЭФР.

Эффективность применения препарата герцептин во многом зависит от выраженности окрашивания опухолевых тканей на белок HER-2/neu, таким образом, можно существенно замедлить или остановить рост опухолей.

Относительно прогностического значения гиперэкспрессии или амплификации гена C-erbB-2 (HER-2/neu) единого мнения не существует.

A. Hamilton и M. Piccart (2000) отмечают положительную корреляцию между экспрессией HER-2/neu и развитием рецидивов у больных РМЖ. Опухоли с амплифицированным геном her-2/neu слабо реагировали на эндокринную терапию, но были чувствительны к последующей химиотерапии. По мнению приведенных авторов, больным с HER-2/neu-положительными опухолями следует рекомендовать более интенсивные режимы химиотерапии, чем больным с опухолями, не имеющими повышенной экспрессии этого онкогена.

Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецепторы (РЭФР), а также трансформирующий фактор роста альфа (ТФРА) и его рецепторы выявлены P. De Miguel с соавт. (1999) в неизмененной, гиперплазированной и неоплазированной ткани предстательной железы человека. ТФРА стимулирует пролиферативную активность эпителиальных клеток предстательной железы. В нормальной простате ЭФР, ТФРА и рецепторы распределяются только в базальном клеточном слое. При ДГП ростовые факторы кроме базального, выявляются и в клетках секреторного эпителия, а рецепторы – только в базальном эпителиальном слое. В аденокарциномах простаты ЭФР, ТФРА и рецепторы выявлялись как в базальном слое желез, так и в клетках секреторного эпителия.

Трансформирующий фактор роста бета- (ТФРБ) обладает функциями торможения и стимуляции пролиферативной активности культуры эпителиальных клеток. В небольших концентрациях этот фактор обладает митогенными свойствами, а в больших концентрациях подавляет клеточный рост. В работе M. Royuela с соавт. (1998) были проведены полуколичественные сравнительные иммуногистохимические исследования распределения ТФРБ и его рецепторов в нормальной предстательной железе, а также при ДГП и формировании аденокарциномы. Было показано, что в неизменной простате распределение ТФРБ и его рецепторов ограничивается базальным слоем железистого эпителия. При ДГП, кроме базального слоя, очаги положительной иммунореактивности к ТФРБ и его рецепторам выявлялись и среди секреторных клеток цилиндрического эпителия, а в случае выявления аденокарциномы простаты, интенсивное диаминобензидиновое окрашивание отмечалось во всех анапластических клетках желез.

Таким образом, достижения в области молекулярной биологии последних лет позволили клиницистам использовать промежуточные филаменты, рецепторы стероидных и пептидных гормонов, различные факторы роста и их рецепторы в качестве прогностических факторов опухолей различной локализации и в выборе их адекватной терапии.