Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с. Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление "Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий"	Содержание
	ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации	Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом ЛИТЕРАТУРА [показать] Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305. Георгиев Г.П. Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm). Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х., Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 169-175. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С. Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. "Итоги науки и техники" ВИНИТИ, серия "Морфология". – 1991. – вып. 15. – 115 с. Франк Г.А. Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом "Династия", 2004. – 88 с. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P. 200-202. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p. De Miguel M.P., Royuela M., Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P. 1131-1139. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P. 801-807. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P. 205-262. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M., Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry. John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml). Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M. Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204. ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ

В основе развития раковых опухолей лежит пролиферация клеток, которая приводит к увеличению числа анапластических элементов.

Цикл деления или пролиферации клеток можно разделить на две основные "сверочные точки" (checkpoints) S и M и две подготовительные точки – G1 и G2. Патология в одной или нескольких этих фазах, контролирующих клеточный цикл, лежит в основе формирования злокачественных опухолей и их прогрессирования в инвазивные формы. S точка определяется как момент репликации ДНК. Полностью дублированные хромосомы разделяются в ядра каждой из 2 дочерних клеток во время митоза в точку M. Во время G1 и G2 фаз происходит синтез клеточных белков, необходимых для осуществления соответствующей фазы клеточного деления.

Универсальным маркером для оценки клеточного цикла является белок Ki-67, по экспрессии которого можно исследовать пролиферативную активность клеток. Антитела к Ki-67 выявляют пролиферирующие клетки, находящиеся в разных фазах цикла. Это наиболее надежный и четкий маркер пролиферации. Антиген Ki-67, выявляемый соответствующими моноклональными антителами, представляет собой короткоживущий протеин, он разрушается в течение 1,5-2 часов. Поэтому, антитела к Ki-67 выявляют только делящиеся клетки, так как Ki-67 не успевает накапливаться и не остается в покоящихся клетках (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2000).

Ki-67 представлен двумя различными формами с молекулярной массой 320 kD и 359 kD. Кодирующий их ген локализуется в 10 хромосоме и состоит из 15 экзонов. Белок Ki-67 в основном связан с хромосомами, выявляется в области теломер, центромер, в ядрышках. Он очень лабилен в присутствии протеаз, это затрудняет его изучение и поэтому связь с белками, регулирующими клеточный цикл, мало изучена и четко не определена. Однако показано, что микроинъекции антител к Ki-67 приводят к снижению пролиферативной активности клеток. В точке G0 клеточного цикла белок не выявляется, также как и в начале G1-фазы первого клеточного цикла. Появление Ki-67 происходит в конце фазы G1, его уровень постепенно нарастает на протяжении S-фазы и достигает максимума к митозу. Ki-67 является надежным индикатором пролиферации практически во всех опухолевых образованиях человека.

Прохождение основных точек клеточного цикла требует активирования внутриклеточных ферментов, известных как циклин-зависимые киназы (Cdk), для активности которых требуется присутствие активаторной субъединицы – циклина. Таким образом, каждая из Cdk не может активироваться пока для неё не будет синтезирован специфический циклин. Экспрессия каждого из циклинов и Cdk изменяется в определенные фазы клеточного цикла. Переход клетки из точки G0 в G1 характеризуется образованием комплексов циклинов D (D1-D3) в зависимости от типа клеток с Cdk4 или Cdk6. Переход из G1 в S связан с образованием комплексов циклина E c Cdk2. Вход в митоз обусловлен образованием комплексов циклина B с Cdc2 и т.д. Другими участниками регуляции клеточного цикла является наличие белков, известных как ингибиторы циклин-зависимых киназ – CKI, которые могут блокировать процессы активирования различных киназ. Имеются два класса ингибиторов Cdk. Один класс тормозит несколько Cdk и включает p21CIP4, p27KIP1 и p57KIP2. Другие ингибиторы Cdk являются специфичными и тормозят эффект отдельных комплексов циклинов с соответствующими Cdk-комплеком циклин D/Cdk4 (или Cdk6) и включают p16INK4, p15INK4B, p18INK4C и p19INK4D.

Выход покоящейся клетки из точки G0 и вступление её в митотический цикл инициируется различными внешними стимулами – цитокинами, принадлежащими к группе факторов роста. Связывание рецепторов со своими лигандами – ростовыми факторами и белками внеклеточного матрикса (фибронектином, коллагеном) индуцирует аутофосфорелирование ферментных систем рецепторов и последующее их взаимодействие с сигнальными белками. В результате этого происходит активация киназных каскадов – MAP (Mitogen Activated Proteins). Конечные продукты этих каскадов – серин-треониновые киназы ERK1/2, JNK и p38 – переходят из цитоплазмы в ядро, где они активируют Cdk и индуцируют переход клетки в точку S.

Торможение клеточного цикла основано на активации CKI семейств Ink4 и Cip/Kip, что приводит к остановке клеточного цикла в определенных его точках G1, S, G2 и M. Синтез, активирование и разрушение подобных CKI регулируется в ответ на митогенные и амитогенные сигналы. Так, регуляция клеточного цикла под действием трансформирующего фактора роста (TGF-β) осуществляется ингибитором Cdk – p27KIP1.

Патологические изменения в механизмах регулирования клеточного цикла достаточно подробно описаны при развитии цервикальной интраэпителиальной неоплазии. Вирус папилломы человека высокого риска вызывает экспрессию вирусного онкогена в реплицирующихся стволовых клетках. На этом этапе продукты генов Е6-Е7 перехватывают контроль клеточного цикла и митотической активности и в дальнейшем индуцируют многоступенчатый мутагенез с тяжелой геномной нестабильностью. Детальный молекулярный анализ этой активности позволил выделить биомаркеры неопластических клеток шейки матки. Выраженная гиперэкспрессия ингибитора циклинзависимой киназы p16INK4a регулярно наблюдается в злокачественных поражениях, вызванных вирусом человеческой папиломы высокого риска и свидетельствует об активной экспрессии вирусного онкогена Е7 в пораженных клетках. Морфологически эти молекулярные расстройства отражаются, в основном, в изменении ядерно-цитоплазматического соотношения, анизонуклеозе, гиперхромазии. При иммуногистохимической реакции на p16INK4a окрашиваются атипические клетки, которые легко могут быть обнаружены даже при малых увеличениях, а при больших увеличениях могут быть отдифференцированы от атрофических или метапластических клеток. В сомнительных случаях помогает дополнительное использование маркеров пролиферации, таких как Ki-67, PCNA и др. Использование новых иммуногистохимических маркеров значительно снижает частоту ложноотрицательных и ложноположительных результатов при традиционных методах диагностики рака и предрака шейки матки.

В отличие от контролируемого различными ферментными системами деления нормальных клеток, быстрая пролиферация опухолевых клеток происходит из-за нарушения регулирующих механизмов работы Cdk в клеточном цикле, в основе которых чаще всего лежит гиперэкспрессия циклина D1 за счет амплификации соответствующего гена, расположенного в хромосоме 11q13. Подобные процессы выявлены при меланоме, раке легких, молочной железы, мочевого пузыря, пищевода и плоскоклеточном раке в области головы и шеи. Гиперэкспрессию циклина D1 в этих опухолях можно выявить иммуногистохимическим методом в большинстве ядер опухолевых клеток. Гиперэкспрессию циклина D1 за счет его транслокации в хромосомах можно также выявить в саркомах, раке толстого кишечника, В-клеточной лимфоме мантийной зоны. Циклин D1 активирует клеточный цикл от G0 до S фазы под влиянием факторов роста, в свою очередь, независимая экспрессия циклина D1 может вызвать автономную активацию циклин D1/Cdk4 и привести к продолжительному делению клеток даже без наличия соответствующих факторов роста. Гиперэкспрессия циклинов D2 и D3 отмечается при раке толстой кишки. Мутации или делеции INK4 – ингибитора Cdk4 и Cdk6 выявлены при наследственных формах меланомы, раках пищевода, поджелудочной железы, легких, яичников, злокачественных опухолях головы и шеи.

Ключевым регулятором G1/S фаз клеточного цикла является и ген rb (ретинобластомы). Белок pRb представляет собой фосфобелок c молекулярной массой 105кД, локализующийся в ядре и экспрессирующийся в большинстве типов клеток. Он дефосфорилирован в неделящихся клетках, а также в пролиферирующих клетках, находящихся в начале точки G1 клеточного цикла. В таком состоянии pRb образует комплексы с рядом белков, в том числе с белками, вызывающими ремоделирование хроматина (гистоновые деацетилазы HDAC, комплексы SWI-SNF) и транскрипционными факторами семейства E2F, регулирующими активность генов, продукты которых необходимы для начала и прохождения S-фазы.

Белок pRb играет ключевую роль в контроле последовательности событий, обеспечивающих переход клетки из G0/G1 в S фазу и ее успешное завершение. При мутациях обоих аллелей гена rb, вызывающих отсутствие в клетке белка pRb или экспрессию его функционально неактивной формы, транскрипционный фактор E2F находится в перманентно активированном состоянии. Это увеличивает вероятность появления постоянно пролиферирующих клонов клеток, в которых будут накапливаться и другие онкогенные мутации, ведущие к злокачественной трансформации. С патологией rb гена связывают возникновение ретинобластомы, мутации этого гена наблюдаются при остеосаркоме и саркомах мягких тканей, раке молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почек, печени, поджелудочной железы, шейки матки, легких и при лейкозах.

Другой важный ингибитор Cdk в фазах G1/S и G2/M клеточного цикла представлен геном p53, этот опухолевый супрессорный ген наиболее часто подвергается мутации при раках.

Основная транскрипционная мишень p53 в системе контроля клеточного цикла – белок p21^Waf1. Повышение экспрессии p21^Waf1/Cip1 в ответ на гиперэкспрессию p53 и повреждение ДНК вызывает остановку клеточного цикла в поздней G1 фазе. P21^Waf1/Cip1 связывается с комплексами [циклин E/Cdc2], тем самым подавляя их способность фосфорилировать белки, активность которых необходима для входа клеток в S фазу. Идентифицирован также ряд генов-мишеней p53, продукты которых вызывают остановку в фазе G2. Задержка в ней наблюдается в случае, когда p53 активировался уже после того, как клетка прошла G1 фазу (Копнин Б.П., 2001). Активированный p53 подавляет функцию комплекса [циклин B/Cdc2]. Во-первых, он трансактивирует ген 14-3-3σ, белковый продукт которого связывает и транспортирует комплексы циклин B/Cdc2 в цитоплазму. Во-вторых, p53 трансактивирует ген GADD45, белковый продукт которого обладает способностью связывать Cdc2, разрушая, таким образом, комплексы циклин B/Cdc2. В-третьих, p53 репрессирует транскрипцию генов циклина B и Cdc2, что уменьшает синтез их продуктов.

Одной из функций p53 является остановка клеточного цикла после повреждения генома в точке G1, это позволяет клетке восстановить целостность поврежденной ДНК до её репликации и деления клетки, если восстановить ДНК не удается, то p53 запускает в клетке механизм апоптоза. Потеря функции p53 снижает стабильность генов, что, в свою очередь, может привести к активированию дополнительных мутаций, приводящих к неопластической трансформации клеток.

В последнее время для определения пролиферативной активности клеток используют молекулярный маркер MCM2 (Mini Chromosome Maintenance protein 2), увеличение экспрессии которого обнаружено при цервикальной интраэпителиальной неоплазии, плоскоклеточных раках шейки матки, кожи, легких, пищевода, переходноклеточном раке мочевого пузыря, аденокарциномах эндометрия и простаты, муцинозной аденокарциноме яичников, почечноклеточном раке, лимфомах, олигодендроглиоме. Величина экспрессии MCM2 коррелирует со степенью дифференцировки опухолей. Индекс метки MCM2 повышен в эпителии полости рта при его дисплазии и является надежным маркером пролиферации клеток. Многие авторы рекомендуют использовать MCM2 в качестве маркера пролиферативной активности клеток наряду с Ki-67 и циклином D1.

MCM2 – белок из семейства MCM (MCM2-7), был обнаружен в дрожжах Saccharomyces cerevisiae как фактор, необходимый для поддержания целостности и стабильности минихромосом. В ранней G1-фазе клеточного цикла на молекуле ДНК происходит сборка молекулы ORC (origin recognition complex – комплекс, распознающий точки начала репликации), Cdc6 (cell division cycle protein 6 – белок регулятор клеточного цикла 6) и MCM в предрепликационный комплекс, что делает ДНК готовой к репликации ("лицензирование" репликации). Сборка предрепликационного комплекса – необходимое условие начальной стадии репликации ДНК, без которого невозможно деление клетки.

Ген mdm2 кодирует белок, который связывает белок P53 и приводит к последующему его разрушению. Большое количество белка MDM2 в клетке приводит к инактивации P53. Гиперэкспрессия этого белка, вызванная амплификацией соответствующего гена, выявляется при различных саркомах.

Пролиферация опухолевых клеток связана с вовлечением тех же механизмов, что и у нормальных клеток, основные изменения наблюдаются при прохождении ключевых точек клеточного цикла. Несмотря на выявление большого количества протоонкогенов и опухолевых супрессоров, вовлеченных в трансдукцию сигналов и нарушения пролиферативных механизмов в ключевых точках клеточного цикла, развитие онкопатологии связано с нарушением системы pRb и p53. Именно мутации этих двух генов наблюдаются в большинстве опухолевых клеток человека, и нарушения Rb и p53 сигнальных путей являются необходимыми для появления постоянно пролиферирующих неопластических клеток.

Таким образом, иммуногистохимические исследования клеточных маркеров пролиферативных процессов при злокачественных опухолях помогают поставить диагноз неоплазии и определить прогноз онкологического заболевания.