Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с. Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление "Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий"	Содержание
	ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации	Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом ЛИТЕРАТУРА [показать] Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305. Георгиев Г.П. Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm). Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х., Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 169-175. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С. Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. "Итоги науки и техники" ВИНИТИ, серия "Морфология". – 1991. – вып. 15. – 115 с. Франк Г.А. Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом "Династия", 2004. – 88 с. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P. 200-202. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p. De Miguel M.P., Royuela M., Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P. 1131-1139. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P. 801-807. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P. 205-262. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M., Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry. John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml). Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M. Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204. ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ

Изменения в генетическом аппарате опухолей связаны с их генетически запрограммированной клеточной гибелью, обозначаемой термином "апоптоз" (Kerr J.F.R. et al., 1972). Программированная клеточная смерть может быть разделена на три фазы: активация сигнала – индукция апоптоза, регуляция и выполнение (эффекторная фаза), структурное клеточное повреждение.

Активация сигнала

Существует широкий диапазон внутренних и внешних стимулов, способных запустить апоптоз: гормоны, цитокины, повреждение ДНК, недостаток ростовых факторов, повышенная экспрессия генов опухолевых супрессоров, факторы гибели, продуцируемые соседними клетками, фармакологические препараты и т.д.

Факторы, способные повреждать ДНК, такие как облучение, цитостатические или генотоксические воздействия также могут запускать апоптоз. Изменения ДНК обнаруживает транскрипторный фактор p53, он блокирует клеточный цикл в фазах G1 и G2 до репликации ДНК и митоза, соответственно, делает возможной репарацию поврежденной ДНК и предотвращает появление мутаций в клетках. Если активность репарационных систем недостаточна и повреждения ДНК сохраняются, то p53 запускает апоптоз, стимулируя транскрипцию некоторых проапоптозных генов, включая bax и fas, что приводит к защите организма от клеток, способных к злокачественной трансформации.

Опухолевый супрессор p53 координирует все основные процессы поддержания стабильности генома, являясь центральным компонентом системы контроля повреждений в клетке. В этом качестве p53 регулирует экспрессию более десяти белков, ответственных за активацию различных супрессорных систем. Среди них – индукторы апоптоза, регуляторы клеточного цикла, секретируемые ингибиторы роста и ангиогенеза. Невыясненной остается функция еще множества генов, для которых p53 также является фактором транскрипции.

В обычных ("нестрессовых") условиях практически весь p53 инактивируется протоонкогеном Mdm2. При возникновении повреждений ДНК белки семейства PI3K фосфорилируют p53 по Ser-15. В результате конформация N-концевого участка р53 меняется таким образом, что он теряет способность связываться с Mdm2. Таким образом, p53 стабилизируется в ядре и приобретает способность связывать базовые транскрипционные факторы.

Число p53-регулируемых генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, невелико, в отличие от огромного и до сих пор растущего числа потенциальных медиаторов p53-зависимого апоптоза. Такое многообразие объясняется тем, что в клетках разных тканей, а также в клетках, находящихся в различных физиологических условиях, могут реализоваться альтернативные программы p53-зависимого апоптоза. При этом p53 контролирует синтез двух основных путей индукции апоптоза: митохондриального и стимулируемого "рецепторами смерти".

Регуляция и выполнение (эффекторная фаза)

Морфологические изменения, которые наблюдали J.F.R. Kerr с соавт. (1972) в апоптотических клетках, являются результатом расщепления белков цитоскелета и ядерной оболочки каспазами (цистеиновыми протеазами). В клетке каспазы синтезируются в форме латентных предшественников – проферментов, называемых прокаспазами. По выполняемой каспазами функции их можно разделить на две основные группы: инициаторные каспазы (8, 9 и 10) и эффекторные каспазы (3, 6 и 7). На этапе активации инициирующих прокаспаз жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие инициирующих каспаз. К ним относятся антиапоптозный белок BCL-2 и проапоптозный белок BAX. После того, как каспазы из первой группы активируют эффекторные каспазы, процесс, запущенный "программой смерти", оказывается необратимым. Активация инициирующих прокаспаз может происходить в ответ на действие лигандов через клеточные рецепторы (внешний апоптотический путь) или в ответ на сигналы из самой клетки (внутренний апоптотический путь).

Внешняя апоптотическая передача сигналов происходит путем активации так называемых "рецепторов смерти", которые представлены рецепторами на поверхности клеток и передают апоптотический сигнал после взаимодействия с определенными лигандами. Рецепторы смерти принадлежат к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR), включающих Fas/CD95, TNFR-1 и TRAIL рецепторы. Все члены TNFR семейства состоят из внеклеточных субдоменов, с помощью которых они и распознают свои лиганды.

Внутренняя апоптотическая передача сигнала происходит путем образования в митохондриальных мембранах мегаканалов, так называемых "гигантских пор". В результате открытия этих пор из митохондрии выходят апоптогенные факторы, которые и запускают механизмы, приводящие к апоптозу. Комплекс BCL-2 взаимодействует с гигантской порой и это взаимодействие является важнейшим звеном регуляции проницаемости митохондрии.

Bcl-2 семейство

Bcl-2 (B cell lymphoma/leukemia-2) гены локализованы на 18 хромосоме и играют важную роль в определении, будет ли клетка необратимо подвержена апоптозу. Известно, что Bcl-2 – только один член этого семейства, состоящего из многочисленных белков, гомологов Bcl-2. Другие члены bcl-2 семейства генов, вероятно, играют важную роль в регулировании апоптоза при помощи механизмов, которые являются противоположными или комплиментарными действию Bcl-2. Члены данного семейства взаимодействуют через гомодимерные или гетеродимерные ассоциации так, что восприимчивость клеток к потенциальному апоптотическому стимулу может быть определена степенью проапоптотических и антиапоптотических воздействий представителей этой группы белков, находящихся в клетке в данное время.

Проапоптозный белок Bax является членом Bcl-2 семейства. Он увеличивает восприимчивость клеток к клеточной смерти, возможно, противодействуя эффекту антиапоптозного белка Bcl-2 на клеточное выживание путем гетеродимерного взаимодействия. Белки Bcl-2 и Bax формируют гомодимеры либо гетородимеры. Bax-Bax гомодимеры индуцируют апоптоз, гетеродимеры Bcl-2-Bax препятствуют процессам апоптоза как в нормальных, так и в патологических тканях.

Другой член этого семейства генов, bcl-x, представляет интересный пример одиночного гена, который через альтернативные связанные механизмы кодирует положительную и отрицательную регуляцию апоптоза. Длинная форма Bcl-X - Bcl-X_long состоит из 233 аминокислот с двумя гомологичными доменами к Bcl-2, тогда как Bcl-X_short (170 аминокислот) – усеченная форма Bcl-X_long, в которой участок высоко гомологичный Bcl-2 удален. Эти две формы Bcl-X имеют противоположное действие, в котором Bcl-X_long придает клеткам устойчивость к апоптозу, тогда как Bcl-X_short противодействует сопротивлению к апоптотической клеточной смерти, обеспечиваемой Bcl-2.

В норме ген р53 функционирует как "молекулярный полицейский", осуществляющий защиту генома. Нарушения процессов апоптоза наступают в том случае, если ген р53 теряет свои функции. Это может произойти в условиях патологии, когда в результате мутации гена p53 образуется его мутантный аналог – mt p53. Мутация p53 приводит к нарушению внутриклеточных механизмов регуляции клеточного цикла и не дает реализоваться апоптозу, чем способствует опухолевому росту.

Белок P53 постоянно синтезируется в клетках, но является короткоживущим белком. Мутации гена p53 ведут к "сверхэкспрессии" этого белка, которые иммуногистохимическим путем выявляются с помощью анти-P53 антител. Мутированный ген р53 является ранним маркером процессов малигнизации и опухолевой прогрессии. Во многих типах опухолей человека обнаружена корреляция между увеличением экспрессии mt p53 и нарастанием морфологической атипии и степени злокачественности. Для иммуногистохимического выявления Р53 широко используются моноклональные антитела. В методическом плане следует подчеркнуть, что дикий тип Р53 – короткоживущий протеин, его период полураспада не превышает 20 минут, поэтому в клетке его очень мало (не больше нескольких тысяч молекул в одной клетке) и его содержание практически может быть ниже чувствительности иммуногистохимических методов. Мутантный тип Р53, напротив, долгоживущий протеин, его период полураспада длится до 24 часов, и он успевает накапливаться в количествах, вполне достаточных для иммуногистохимической идентификации. Считается, что иммуногистохимическая положительная реакция полностью зависит от наличия мутантного типа Р53 (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2000).

Несмотря на обилие методов выявления апоптоза, данные относительно его развития в клетках неоднозначны, основные противоречия связаны с особенностями методических приемов при изучении программированной клеточной гибели. Для разрешения описанных выше недостатков методов И.И. Бабиченко с соавт. (2002) предложили новый подход к изучению апоптоза, позволяющий оценивать его с принципиально новых позиций, т.е. оценивать его признаки до развития фрагментации ядер.

Для оценки апоптоза был использован новый фактор дифференцировки клеток HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor), который первоначально был выделен из среды культивирования промиелоцитарного лейкоза человека HL-60, обработанных полностью-транс-ретиноевой кислотой. Данный фактор представляет собой небольшой гликозилированный белок с молекулярной массой 8.2 кДа, индуцирующий дифференцировку исходных активно пролиферирующих клеток HL-60 по гранулоцитарному пути (Костанян И.А. и др., 1994).

HLDF играет важную роль в процессе апоптоза, поскольку как сам фактор HLDF, так и его ДНК-гидролизующий фрагмент, принимают участие в процессах запрограммированной гибели клеток. Скорее всего, зрелый фактор дифференцировки (и его предшественник) непосредственно участвуют во фрагментации ДНК в клетках миелоидного ряда с запущенным процессом программированной гибели. Направления развития метаболизма – апоптоз, или дифференцировка – зависят от физиологического состояния клетки. Были получены поликлональные антитела против фактора дифференцировки HLDF. Специфичность связывания антител подтверждалась иммуноблоттингом с синтезированным пептидом HLDF. Иммуногистохимическое окрашивание клеток HL-60 с помощью поликлональных антител против HLDF показало, что только в дифференцированных под воздействием ретиноевой кислоты или введенных в апоптоз обработкой церамидом C2-Cer (N-ацетил сфингозин) в течение суток клетках, наблюдается специфическое точечное окрашивание ядер и цитоплазматической мембраны. При этом более интенсивное окрашивание наблюдается в апоптотических клетках.

Результаты иммуногистохимических исследований позволяют сделать заключение, что фактор HLDF может быть использован в качестве маркера апоптоза. Гиперэкспрессия этого фактора в цитоплазме клеток, содержащих ядра, позволяет оценивать ранние фазы развития программированной клеточной смерти, еще до формирования апоптозных телец.

Патология процесса апоптоза в клетках играет важную роль в накоплении генетических клеточных повреждений, ответственных за развитии опухолевой прогрессии. При этом опухолевые клетки получают возможность выживать без наличия экзогенных факторов роста, становятся устойчивыми к гипоксии, активизируют пролиферативные процессы, в них нарушается дифференцировка, клетки стимулируют ангиогенез, приобретают клеточную подвижность и инвазивный рост. Нарушения апоптоза активируют метастазирование, позволяя отдельным эпителиальным клеткам выживать вне связи с внеклеточным матриксом. Таким образом, патология апоптоза является фундаментальной причиной возникновения злокачественных опухолей.

Существуют некоторые взаимосвязи между регуляцией пролиферации клеток и апоптозом. Так, известно, что в большинстве медленно пролиферирующих опухолей, таких как хронический лимфоцитарный лейкоз, индолентные Неходжкинские лимфомы, миелома, а также раки толстого кишечника и молочной железы, наблюдается гиперэкспрессия антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-XL. Имеются данные, что Bcl-2 и родственные ему белки обладают двумя различными функциями: они не только тормозят апоптоз, но и вхождение клетки в клеточный цикл. Замедление вхождения клетки в клеточный цикл можно связать с лучшим прогнозом у пациентов с раком молочной железы и высоким уровнем экспрессии Bcl-2. Неактивные лейкозные клетки также гиперэкспрессируют Bcl-2 и Bcl-X_L, по сравнению с активно пролиферирующими аналогами.

Таким образом, апоптоз представляет собой универсальный механизм физиологической и патологической гибели клеток. Феномен апоптоза привлек к себе внимание исследователей тем, что он расширил представление о механизмах возникновения как опухолевых, так и неопухолевых заболеваний. Если раньше считалось, что опухоли возникают только за счет неконтролируемой пролиферации клеток, то сейчас установлено, что нарастание клеточной массы может происходить также и за счет нарушения процесса гибели клеток.