Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с. Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление "Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий"	Содержание
	ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации	Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом ЛИТЕРАТУРА [показать] Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305. Георгиев Г.П. Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm). Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х., Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 169-175. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С. Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. "Итоги науки и техники" ВИНИТИ, серия "Морфология". – 1991. – вып. 15. – 115 с. Франк Г.А. Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом "Династия", 2004. – 88 с. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P. 200-202. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p. De Miguel M.P., Royuela M., Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P. 1131-1139. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P. 801-807. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P. 205-262. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M., Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry. John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml). Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M. Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204. ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ

При формировании ткани и в ходе ее функционирования важную роль играют процессы межклеточных коммуникаций – узнавание и адгезия. Узнавание – это специфическое взаимодействие клетки с другой клеткой или внеклеточным матриксом; в результате узнавания неизбежно развивается ряд процессов, одним из которых является адгезия. Адгезия – необходимое условие поддержания тканевой структуры. Адгезией называют способность клеток избирательно прикрепляться друг к другу или к компонентам внеклеточного матрикса посредством специальных гликопротеинов – молекул адгезии. Прикрепление клеток к компонентам внеклеточного матрикса осуществляют точечные (фокальные) адгезионные контакты, а прикрепление клеток друг к другу – межклеточные контакты.

Молекулы клеточной адгезии могут способствовать инвазии опухоли и метастазированию. Пусковым механизмом прогрессирования опухоли может стать изменение межклеточных связей в её ткани, которое также играет важную роль на различных этапах метастатического каскада.

Инвазия опухоли протекает в три фазы и связана с генетическими перестройками, которые заключаются в дефектах генов, кодирующих гликопротеины клеточной адгезии. Клетки способны к перемещению только после дезинтеграции адгезионных контактов. Подобные процессы происходят при выселении злокачественных клеток из опухоли и их метастазировании, когда отдельные трансформированные клетки отделяются от опухоли, мигрируют и образуют новые опухолевые очаги (метастазы). Например, метастазы и разрастания карцином желудка, эндометрия, яичника возникают вследствие нарушения адгезии опухолевых клеток, содержащих мутантный ген Е-кадгерина, и экспрессии его дефектного продукта.

Первая фаза инвазии опухоли характеризуется ослаблением контактов между клетками, о чем свидетельствуют уменьшение количества межклеточных контактов, снижение концентрации некоторых адгезивных молекул и, наоборот, усиление экспрессии прочих, обеспечивающих мобильность опухолевых клеток и их контакт с экстрацеллюлярным матриксом. На клеточной поверхности снижается концентрация ионов кальция, что приводит к повышению отрицательного заряда опухолевых клеток. Усиливается экспрессия рецепторов, обеспечивающих прикрепление клетки к компонентам экстрацеллюлярного матрикса – ламинину, фибронектину, коллагенам. Во второй фазе опухолевая клетка секретирует протеолитические ферменты и их активаторы, которые обеспечивают деградацию экстрацеллюлярного матрикса, освобождая тем самым ей путь для инвазии. В то же время продукты деградации фибронектина и ламинина являются хемоаттрактантами для опухолевых клеток, которые мигрируют в зону деградации в ходе третьей фазы инвазии, а затем процесс повторяется снова.

Особенности экспрессии и распределения молекул клеточной адгезии в ткани опухоли могут служить дополнительными критериями злокачественности при оценке прогноза заболевания. В частности, рассматриваемые ниже Е-кадгерин, катенины, СD44, матриксные металлопротеиназы – выступают в качестве маркеров инвазии и метастазирования.

Прочность адгезивных связей клеток обеспечивают Е-кадгерин, относящийся к семейству кадгеринов, и протеогликан CD44.

Кадгерины – трансмембранные гликопротеины, имеющие аминотерминальную экстрацеллюлярную часть, трансмембранный компонент и внутриклеточный домен, локализующийся в цитоплазме клеток, – являются важными элементами межклеточных связей и в системе передачи сигналов, осуществляющих контроль миграции, роста и дифференцировки клеток.

Е-кадгерин – представитель семейства классических кадгеринов, кальций-зависимая адгезивная молекула, характерная для клеток эпителиальных тканей. Длинные экстрацеллюлярные участки молекулы Е-кадгерина формируют на поверхности клеток параллельные димеры, которые при контакте с другими молекулами Е-кадгерина соседних эпителиальных клеток образуют прочные связи по типу молнии ("zippers"). Цитоплазматический домен Е-кадгерина взаимодействует с цитоплазматическими протеинами: бета-катенином и гамма-катенином. Эти молекулы реагируют с альфа-катенином, который, в свою очередь, связывает кадгерин-катениновый комплекс с актиновым цитоскелетом. Эта система обеспечивает стабильные межклеточные адгезивные связи, а молекулы катенинов – регуляцию функции молекул Е-кадгерина.

Нарушение процессов регуляции функции молекул кадгеринов и катенинов происходит при мутации соответствующих генов. Мутантные молекулы Е-кадгерина утрачивают способность связываться с катенинами, а соответственно, и с актиновыми волокнами, в результате чего нарушается стабильность межклеточных контактов. Генетические альтерации бета-катенина нарушают взаимодействие между Е-кадгерином и альфа-катенинами и также приводят к снижению межклеточной адгезии.

Патологические изменения Е-кадгерин-связанной межклеточной адгезии ведут к опухолевой прогрессии и метастазированию. Онкогенный эффект мутаций Е-кадгерина связан с нарушениями морфогенетических свойств клетки. Кроме того, Е-кадгерин, вероятно, участвует в регуляции активности протеина клеточного цикла р53, в связи с этим можно полагать что онкогенное действие мутаций Е-кадгерина влияет на регуляцию клеточного цикла, апоптоз и контроль генетической стабильности тканей.

В настоящее время отмечена положительная корреляция между распределением Е-кадгерина и плохим прогнозом для различных опухолей. Невысокая экспрессия Е-кадгерина и катенинов в эпителиальных новообразованиях и меланомах ассоциирована с низкой дифференцировкой опухоли, локальной инвазией, вовлечением регионарных лимфоузлов и меньшей продолжительностью жизни.

Как правило, чем ниже дифференцировка опухоли, тем меньше экспрессия E-кадгерина в ткани. Это характерно для карциномы мочевого пузыря, поджелудочной железы, гепатоцеллюлярного рака, в которых наблюдается соответственно снижение альфа-катенина и бета-катенина. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Е-кадгерину в высокодифференцированной аденокарциноме толстого кишечника, как правило, демонстрирует фокальное окрашивание опухоли, в умереннодифференцированной – с полями неоднородного слабого окрашивания структур, в низкодифференцированной – опухолевые клетки Е-кадгерин негативные.

CD44 – трансмембранный гликопротеин, участвующий в межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействиях и обладающий свойствами рецептора гиалуроната. Существует всего 11 разновидностей CD44 – стандартная, или так называемая гемопоэтическая изоформа (CD44H или CD44s), и 10 вариантных изоформ (CD44v), которые образуются при альтернативном сплайсинге.

Молекулы CD44 играют важную роль в процессе развития опухолей и, как полагают, способствуют опухолевой прогрессии. CD44 способен стимулировать клеточную пролиферацию, миграцию и изменение дифференцировки клеток первичной опухоли. Экспрессия молекул CD44 значительно усиливается в клетках новообразований. При взаимодействии с гиалуронат-содержащими структурами, которые входят в состав многих компонентов экстрацеллюлярного матрикса: коллагена, ламинина, хондроитина сульфата, фибронектина и др.

CD44 способствует передаче межклеточных сигналов, стимулирует моторную и пролиферативную активность клеток. Обладая протеазным действием, CD44 разрушает протеины экстрацеллюлярного матрикса, особенно богатого гиалуронатами, и способствует инвазии опухолевых клеток, проникновению их через базальную мембрану и сосудистые стенки в кровеносное русло.

Выраженная экспрессия CD44 отмечается не только в эпителии опухолей, но и в клетках стромы – лимфоцитах, макрофагах и в компонентах экстрацеллюлярного матрикса. Характерно, что экспрессия CD44 в строме никак не связана с его экспрессией в опухолевых клетках. Однако имеются работы, в которых отмечалась стимуляция иммунной реакции опухолевыми клетками. Известно, что CD44 также является маркером активации лимфоцитов. Стромальные элементы опухоли оказывают значительное влияние на регуляцию роста опухоли, а аномалии молекул CD44 способствуют перестройке компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Существуют работы, в которых выявлена корреляция между прогнозом развития опухоли и иммунореактивностью клеток к CD44.

Во многих опухолях человека, таких как колоректальный рак, неходжкинская лимфома, рак молочной железы и меланома, белок CD44 может быть использован как диагностический и прогностический маркер.

В значительной степени прогноз результата лечения онкологических больных зависит от оценки вероятности развития метастазов. До настоящего времени исследователи не располагают достаточно четкими критериями, позволяющими распознать новообразования с высоким метастатическим потенциалом. Тем не менее, степень инвазивного роста и метастазирование опухолевых клеток может определяться по их способности расщеплять компоненты экстраклеточного матрикса (ЭКМ) – базальные мембраны и межтканевую строму, состоящую из различных структурных белков: коллагенов, эластинов, ламининов и т.д. Преодоление базальной мембраны и продвижение по внеклеточному матриксу обеспечиваются секрецией протеаз. Многие протеолитические ферменты, такие как катепсины, сериновые протеазы, способны лизировать отдельные компоненты ЭКМ in vitro, однако разлагать все структуры ЭКМ могут только матриксные металлопротеиназы.

Матриксные металлопротеиназы (ММП) – это семейство ферментов, которые способны разрушать внеклеточный матрикс или базальную мембрану. Они играют важную роль в росте опухоли и метастазировании, так как обеспечивают миграцию и внедрение опухолевых клеток. Активность этих ферментов регулируется тканевыми ингибиторами и активаторами.

Свое название матриксные металлопротеиназы получили за способность специфически гидролизовать основные белки экстраклеточного матрикса. ММП относятся к семейству цинковых металлопротеиназ, так как содержат в активном центре Zn²⁺. Известно около 20 представителей этого семейства.

Большинство ММП секретируется клетками в виде неактивных ферментов. В обычных условиях в тканях обнаруживаются незначительные количества ММП, при этом их активация приводит к протеолитическому разрушению окружающих клетку белков. Активацию большинства ММП осуществляют протеазы типа плазмина и активатора плазминогена урокиназного типа. Некоторые ММП могут активизировать друг друга. В норме существует биологический механизм ограничения протеолиза тканей, вызванного активными ММП, в виде секреции клетками стромы тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP). В настоящее время хорошо изучены три ТIМP из различных тканей человека – ТIМP-1, ТIМP-2, ТIМP-3. Это белки небольшого размера, способные формировать нековалентные комплексы со многими членами семейства матриксных металлопротеиназ.

Злокачественные опухоли характеризуются инвазивным ростом и способностью к метастазированию. Деградация базальной мембраны и стромы - пусковой фактор начала этих процессов. Многие опухоли имеют локально увеличенные уровни матриксных металлопротеиназ, ферментов, способных разлагать любой белок матрикса, что позволяет многим исследователям связывать их с инвазивным фенотипом опухоли. В свое время поиск ферментов, способных к разложению базальных мембранных коллагенов, привел к идентификации ММП-2, известной как коллагеназа IV типа.

В клинических исследованиях присутствие больших количеств активной ММП-2 связано с инвазивными раком молочной железы и карциномой легкого. У больных раком гортани наблюдалась корреляция между экспрессией ММП-2 и наличием метастазов в лимфатических узлах. Таким образом, продукция ММП-2 опухолевыми клетками может свидетельствовать об их инвазивном потенциале.

В последнее время происходит активный поиск прогностических биохимических маркеров, которые могли бы выявлять пациентов с высоким риском возникновения рецидивов. На роль таких факторов прогноза претендуют многие опухолеассоциированные протеазы. Так, большое количество работ по раку молочной железы показало, что определение содержания протеазы активатора плазминогена урокиназного типа и его ингибиторов может иметь огромное прогностическое значение в оценке возникновения рецидивов. Кроме того, высокие уровни TIMP-2 в ткани рака молочной железы коррелируют с сокращением времени ремиссии и полного выживания, а высокий уровень ММП-11 связан с плохим прогнозом.

Матриксные металлопротеиназы в настоящее время активно исследуются как прогностические факторы при многих других локализациях опухолевого процесса. Показатели экспрессии мРНК ММП-9 и TIMP-2 могут предсказать возникновение рецидива у больных с поверхностной переходноклеточной карциномой мочевого пузыря. Другие исследователи рекомендуют оценивать уровни экспрессии ММП-2, TIMP-2 и ММП-14 (активатора ММП-2) для прогноза выживаемости при инвазивных раковых образованиях мочевого пузыря.

Описаны также уровни разновидностей ММП при опухолях других локализаций: повышенная экспрессия MMП-2 и MMП-9 обнаруживалась при инвазивных карциномах головы и шеи, экспрессия TIMР-2 коррелировала с локальной инвазией опухоли. Прогностическая важность уровней ММП-2 была описана у больных раком простаты, а уровней ММП-2 и ММП-9 – у больных раком желудка и у больных раком гортани. ММП-7 – основная металлопротеаза, продуцируемая клетками аденокарциномы пищевода, и ее экспрессия характеризует агрессивные инвазивные опухоли. ММП-11 в настоящее время считается маркером прогрессии опухоли ободочной кишки и рака молочной железы, её присутствие свидетельствует о плохом прогнозе заболевания. Обратная корреляция наблюдалась между уровнями экспрессий TIMP-2, TIMP-3 и стадией опухолевого процесса в опухолях гипофиза.

Таким образом, в настоящее время бесспорной является роль молекул адгезии не только в процессах эмбрионального развития, воспаления, иммунного ответа, формирования тромба, апоптоза, роста, регенерации, но также и в возникновении рецидивов и метастазировании опухолевых образований.