Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с. Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление "Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий"	Содержание
	ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации	Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом ЛИТЕРАТУРА [показать] Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305. Георгиев Г.П. Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm). Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х., Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 169-175. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С. Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. "Итоги науки и техники" ВИНИТИ, серия "Морфология". – 1991. – вып. 15. – 115 с. Франк Г.А. Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом "Династия", 2004. – 88 с. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P. 200-202. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p. De Miguel M.P., Royuela M., Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P. 1131-1139. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P. 801-807. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P. 205-262. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M., Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry. John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml). Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M. Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204. ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ

Формирование кровеносных сосудов и/или кровеносной системы определяется двумя процессами: васкулогенезом и ангиогенезом.

Васкулогенез заключается в дифференцировке ангиобластов (предшественников эндотелиальных клеток) у эмбрионов в кровяных островках, которые после слияния формируют сердечно-сосудистую систему или васкуляризируют эндодермальные органы.

Ангиогенез включает в себя пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток в первичных васкулярных структурах и способствует васкуляризации эктодермальных и мезенхимных органов, реконструкции капиллярной сети.

Ангиогенез необходим для процессов заживления ран, развития многих эмбриональных тканей и плаценты, а также для циклических репродуктивных изменений в женском организме, связанных с формированием желтого тела, ростом эндометрия и лактацией.

Факторы, стимулирующие образование кровеносных сосудов, носят название ангиогенных. К ним относятся: фактор роста сосудов эндотелия (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF), ангиогенин, трансформирующий фактор роста-α (TGF-α). Все ангиогенные факторы можно подразделить на 2 группы: первая непосредственно влияет на эндотелиальные клетки, вторая является группой факторов, осуществляющих свое действие опосредованно через макрофаги, которые выделяют факторы роста и цитокины. К факторам второй группы принадлежит ангиогенин.

В новообразованиях процессы неоваскуляризации составляют важный компонент инвазивной и метастатической активности. Данные, накопленные за последнее десятилетие, убедительно показывают необходимость ангиогенеза для роста подавляющего большинства злокачественных опухолей. Формирование сети капилляров из эндотелиальных клеток, выстилающих мелкие венулы, – необходимое условие для дальнейшего роста опухолевого узелка, достигшего в диаметре 2-4 мм. Процессы образования и роста кровеносных сосудов необходимы и для развития метастазов.

Капиллярная сеть сначала развивается в прилежащих к опухоли тканях, которые впоследствии замещаются неопластическими клетками. При этом, хотя капиллярная сеть, окружающая опухоль, формируется из клеток нормального эндотелия организма, однако заметно отличается от нормальной по морфологии, плотности и проницаемости сосудов. Плотная сеть капилляров снабжает развивающуюся опухоль кислородом, необходимыми питательными веществами и позволяет выводить токсичные продукты жизнедеятельности опухолевых клеток. Наличие капиллярной сети облегчает также внедрение и распространение клеток метастазирующих опухолей. Таким образом, для того чтобы злокачественное новообразование превысило в толщину несколько слоев живых клеток, необходима высокоспециализированная система капилляров.

Экспериментальные данные последних лет позволяют предположить, что подобная сеть образуется не как результат иммунной реакции организма на воспаление или некроз, а в ответ на вполне определенные сигналы, вырабатываемые опухолевыми клетками. Способность неопластических клеток стимулировать пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток связана с двумя основными событиями. Во-первых, прекращением секреции ими факторов, ингибирующих ангиогенез (например тромбоспондинов), и, во-вторых, увеличением продукции цитокинов – стимуляторов ангиогенеза, являющихся факторами роста и митогенами для эндотелиоцитов (в первую очередь, VEGF, а также FGF, EGF, TGF-α) и повышением секреции и/или активности протеаз, обеспечивающих протеолиз внеклеточного матрикса и инвазию эндотелиоцитов в ткани новообразования.

Установлено, что из многих ростовых факторов, участвующих в ангиогенезе, VEGF (фактор роста сосудов эндотелия) является самым мощным и доминирующим медиатором этого процесса. VEGF – гликопротеин, связывающийся только с эндотелиальными клетками и стимулирующий их пролиферацию. Этот фактор усиленно продуцируется клетками опухолей человека, способствуя неоваскуляризации опухоли и, возможно, связанной с этим ранней ее диссеминации. Помимо ангиогенного действия, VEGF значительно усиливает проницаемость сосудов.

Экспрессия VEGF значительно ниже в опухолях, не содержащих р53 мутантного типа и с низкой степенью васкуляризации. Уровень экспрессии VEGF в плоскоклеточных карциномах обратно коррелирован с общей выживаемостью пациентов и был выше в опухолях легкого с метастазами в лимфоузлы. VEGF считается важной терапевтической мишенью при разработке антиангиогенных противоопухолевых препаратов.

Оценка ангиогенеза в опухоли считается одним из маркеров прогноза течения заболевания, наличия метастазов и чувствительности к противоопухолевой терапии. Возникновение метастазов – основная причина смертности больных раком, поэтому идентификация маркеров, тесно связанных с метастатическим потенциалом каждой отдельной опухоли, клинически необходима для планирования терапии больных раком.

Появляется все большее количество доказательств, что метастазирование как на ранних, так и на поздних стадиях зависит от степени васкуляризации опухоли. При метастазировании гематогенным путем опухолевые клетки должны прикрепиться к эндотелию, пройти в просвет сосуда, выжить в циркулирующей крови, остановиться в какой-либо отдаленной ткани и образовать там колонию. Клиническая значимость определения количества сосудов в опухоли продемонстрирована для опухолей различных типов: чем выше плотность сосудов, тем хуже прогноз для пациента. Высокоангиогенные первичные опухоли с высокой внутриопухолевой плотностью сосудов обладают большей способностью дать в отдаленном органе ангиогенный клон, который при благоприятных условиях образует метастаз.

Проводится огромное количество исследований, подтверждающих, что ангиогенез в опухоли является независимым прогностическим маркером. Хотя имеются значительные различия в исследованных группах пациентов и используемых методах оценки ангиогенеза, большинство исследований продемонстрировали обратную связь между опухолевой васкуляризацией и выживаемостью пациентов. Этот факт характерен для опухолей различных локализаций, в частности, для рака молочной железы, рака шейки матки, рака легкого, рака простаты, рака пищевода, рака мозга, рака мочевого пузыря, рака яичка, рака пищевода, рака прямой кишки, мягкотканных сарком, опухолей головы и шеи и т.д.

Главное требование для новых прогностических маркеров – их биологическая роль, должна быть связана с агрессивностью каждой отдельно взятой опухоли. Плотность микрососудов в опухоли как прогностический маркер полностью отвечает этому требованию по нескольким причинам. Во-первых, ангиогенез необходим для перехода от преинвазивной (карцинома in situ) к инвазивной стадии первичной опухоли. Во-вторых, в инвазивных опухолях, даже в одинаковых гистологических типах, ангиогенная активность опухоли различается, что показано на примере опухолей молочной железы. Это делает возможным разделить пациентов по степени ангиогенной активности опухоли. В-третьих, клинико-патологические исследования показали, что плотность микрососудов в опухоли не связана с экспрессией некоторых других биологических маркеров, включая P53, C-erbB-2, EGFR, рецепторов гормонов. Это - биологическая основа независимой оценки ангиогенеза как прогностического маркера. И, наконец, высокая ангиогенная активность опухоли способствует развитию местных и отдаленных метастазов.

Широко используемым методом оценки ангиогенеза в опухолях человека является подсчет микрососудов в первичной опухоли с помощью специфических маркеров эндотелиальных клеток, таких как VIII-фактор, CD31, CD34, и стандартной иммунопероксидазной техники окраски сосудов.

Согласно работам, наиболее чувствительным из доступных панэндотелиальных маркеров являются антитела к фактору CD31. Он распознает большее количество микрососудов, чем другие эндотелиальные маркеры. В частности, CD34 и VIII-фактор окрашивают не все опухолевые сосуды, а антитела к VIII-фактору реагируют также с лимфоцитами. Однако специфичность антител к CD31 тоже не абсолютна, так как они дают положительную реакцию с плазматическими клетками. Следует подчеркнуть, что описанные маркеры окрашивают как покоящийся, так и активированный/пролиферирующий эндотелий.

В заключение следует отметить, что определение и исследование биологических характеристик ангиогенеза опухолей может иметь важнейшее значение не только для лучшего понимания причин развития первичной опухоли и метастазов, но и для лучшего планирования лечения. За последнее время наши знания о биологических процессах, вовлеченных в формирование новых микрососудов, значительно расширились. И хотя прогностические и терапевтические принципы еще только формируются, достижения в понимании патологии ангиогенеза используются в клинической практике и, возможно, оценка ангиогенеза будет применяться в рутинной клинической деятельности.