Приложение

Практические рекомендации

В данных рекомендациях использованы: Инструкция по идентификации грибов рода Candida, разработанная в Центральном кожно-венерологическом институте (Москва, 1957), руководства П. Н. Кашкина (1958, 1962), П. Н. Блинова (1964), П. Н. Кашкина, Н. Д. Шеклакова (1978), В. М. Лещенко (1982), П. Н. Кашкина, В. В. Лисина (1983) с учетом тридцатилетнего опыта работы нашего коллектива.

Исследование биоматериала на присутствие грибов рода Candida складывается из нескольких этапов:

1. взятие материала от больных;
2. микроскопическое исследование;
3. микологическое исследование - выделение культур грибов и их идентификация.

Обычно микроскопическое исследование материала проводится одновременно с посевом или посев делается сразу, без микроскопии. От техники и времени во многом зависит результат исследования. Желательно делать посевы непосредственно после взятия материала.

Взятие и посев биоматериала от больных. У больных с бактериальными инфекциями зева (хронический тонзиллит, ангина, дифтерия и др.), а также у носителей дифтерийных бактерий для исследования берут стерильным тампоном (лучше стандартным - 2 мг ваты) материал со слизистых оболочек рта и зева: сначала с внутренней поверхности щек, неба, губ, затем с языка, особенно тщательно протирая тампоном спинку и область, прилежащую к корню языка, а в заключение - круговым движением из зева.

Тампоны следует быстро доставить в лабораторию (не позднее 2 ч), лучше произвести посев материала сразу после его взятия.

Посев можно сделать одним из следующих способов (однако важно при повторных исследованиях пользоваться одной и той же методикой):

1. поместить тампон в колбу с 10 мл сусла или жидкой среды Сабуро с бусами, встряхивать в течение 5 мин (не замочив пробку), из полученного разведения 1:10 сделать мерно высев на чашку со средой Сабуро или кандида-агаром для выделения чистой культуры, подсчета выросших колоний и дальнейшего пересчета количества клеток на один тампон или на 1 мл смыва;
2. пользуясь постоянно стандартной методикой посева, вращая тампон, засеять материал на чашку по секторам - с целью дальнейшего подсчета количества колоний, выросших в первичном посеве на чашке, и выделения чистой культуры гриба.

При заболеваниях дыхательных путей исследуют мокроту и слизь из полости рта и зева (по той же методике). Мокроту собирают в стерильную баночку с бусами и обязательно гомогенизируют в течение 5-10 мин в аппарате для встряхивания. Гомогенизированную мокроту разводят в любой жидкой питательной среде или физиологическом растворе (1:2; 1:10; 1:100 и т. д.) и высевают из каждого разведения по 0,1 мл на две хорошо подсушенные чашки со средой Сабуро или кандида-агаром. Количество разведений зависит от степени обсемененности материала грибами (предварительно определяется при микроскопическом исследовании мазков из мокроты). Можно оставить колбу с мокротой на сутки, чтобы посмотреть рост на чашках и при необходимости повторить посев из колбы, подобрав нужные разведения.

У больных кишечными инфекциями для исследования берут фекалии, желчь (при вирусном гепатите), слизь из зева и полости рта. Фекалии (навеска в 1 г) разводят 9 мл стерильного физиологического раствора в широкой пробирке или небольшой колбе, тщательно перемешивают стерильной стеклянной палочкой и оставляют на 10 мин. При значительной обсемененности фекалий грибами готовят последующие разведения. Из каждого разведения делают высевы по 0,1 мл на две чашки со средой Сабуро или кандида-агаром.

Порции А, В, С желчи при вирусном гепатите берут прокипяченным зондом, который вводят больному сразу после полоскания полости рта 3-5% раствором натрия гидрокарбоната. Посевы желчи делают мерно (по 0,1 мл) на чашки с плотными средами (Сабуро, кандида-агар, Плоскирева, Левина, желточно-солевой и кровяной агар) с целью дальнейшего изучения сравнительной обсемененности трех порций грибами и бактериями.

При заболеваниях мочеполовой системы отделяемое из влагалища или уретры берут стерильным тампоном с использованием методик посева, описанных выше. Мочу следует брать стерильным катетером (за исключением маленьких детей, которым нужно просто тщательно обмыть половые органы) и сеять можно не мерно, так как в норме моча не содержит грибов. Лучше взять 50-100 мл мочи, отцентрифугировать ее, а осадок исследовать микроскопически и посеять на питательные среды.

При кожных заболеваниях исследуемым материалом могут быть кожные чешуйки, гной из очагов пиодермии, из-под ногтевого валика и т. д. Их берут стерильным стандартным тампоном. При поверхностном кандидозе берут те же материалы, пользуясь теми же методиками, но при висцеральном кандидозе и кандидозном сепсисе, кроме того, могут исследоваться кровь, спинномозговая жидкость, кусочки биопсированной ткани и трупный материал. Кровь берут стерильно из локтевой вены в объеме 5-10 мл и засевают во флакон с жидкой средой Сабуро сразу у постели больного.

Спинномозговую жидкость берут стерильно при пункции и так же, как кровь, засевают сразу в жидкую среду. Можно отцентрифугировать взятую жидкость, а осадок микроскопировать и засеять в жидкую среду. Кусочки тканей и органов исследуют гистологически [Хмельницкий О. К., 1984].

При бактериальных, вирусных, протозойных и других инфекциях при отсутствии клинических признаков кандидоза, когда грибы рода Candida являются не возбудителями, а лишь участниками микробных ассоциаций, достаточно обнаружить их, определить степень обсемененности ими, выделить в чистой культуре и идентифицировать до вида, а при затруднительных условиях работы можно закончить идентификацию на уровне рода.

В большинстве случаев взятый от больных бактериальными и другими инфекциями материал сразу после взятия изучают одновременно двумя методами - микроскопическим и микологическим (культуральным).

Микроскопическое исследование. Микроскопия материала позволяет лишь ориентировочно познакомиться с микрофлорой, а иногда выявить наличие грибов и приблизительно судить об их количестве в материале, чтобы решить вопрос о необходимости и степени разведения материала перед посевом. Этот метод предварительный и иногда совсем не используется. Микроскопируют неокрашенные и окрашенные препараты.

Для выявления грибов в неокрашенном состоянии на комочек исследуемого материала наносят каплю 10% едкой щелочи, или смеси спирта с глицерином (спирта и глицерина по 1 части, воды 2 части), или раствора Люголя (кристаллического йода 1 г, йодида калия 2 г, воды 150 мл). Препарат можно накрыть покровным стеклом.

Окрашивают препараты простым методом: 1% спиртовым раствором метиленового синего 1-3 мин, 1% водным раствором фуксина 0,5-1 мин. Используют также метод окраски по Граму, по Цилю - Нильсену, по Романовскому - Гимзе. Лучшие результаты в нашей лаборатории получают при окраске препаратов 1% спиртовым раствором генцианового фиолетового в течение 2-3 мин (удобно заранее пропитать этим раствором полоски фильтровальной бумаги, которые затем накладывают на препарат в каплю воды). При микроскопическом исследовании выявляют клетки типичной морфологии (овальные, круглые), в некоторых случаях с почкой (всегда одной), псевдомицелий, иногда хламидоспоры, определяют типы филаментации. Однако в препарате из исследуемого материала обычно видны только клетки грибов, редко псевдомицелий. Все другие элементы морфологии грибов выявляются в ходе исследования выделенной культуры гриба.

Выделение чистых культур грибов и их идентификация. Посевы материалов от больных делают на разные питательные среды с pH 6,0-6,5. Удобно использовать для этого плотную и жидкую среды Сабуро, мясопептонный агар, бульон с глюкозой и кандида-агар. Для количественного исследования посевы следует производить на плотные среды.

Засеянные среды выдерживают в термостате при температуре 37° C в течение 48 ч.

Второй этап микологического исследования проводится через двое суток после посева материала, когда на чашках вырастают колонии. Он включает четыре момента:

1. отбор характерных однотипных колоний грибов и подсчет их; если засевалось несколько разведений, то подсчитывают количество колоний на двух чашках последнего разведения, где есть рост, а затем делят пополам и делают пересчет на 1 г, 1 мл или 1 тампон с учетом разведения и количества засеянного материала;
2. микроскопия окрашенных (генцианвиолетом) препаратов для проверки чистоты культуры и изучения морфологии клеток, иногда при этом обнаруживается псевдомицелий и тогда сразу определяется принадлежность гриба к роду Candida;
3. пересев из колонии на мясопептонный бульон (МПБ) с глюкозой или хламидоспор-агар для выявления псевдомицелия (если он не обнаружен в мазке из колоний);
4. пересев из колонии на скошенную среду Сабуро или сусло-агар в пробирке для выделения чистой культуры.

В случае отсутствия типичных колоний грибов чашки сохраняются 7 дней и лишь тогда, если грибы не вырастут, выдается отрицательный ответ.

На втором этапе обеспечивается выделение чистой культуры гриба и начинается его идентификация.

Третий этап микологического исследования - идентификация выделенной культуры гриба, включающая определение принадлежности к дрожжеподобным грибам рода Candida и определение вида гриба.

В практических лабораториях обычно ограничиваются определением рода, а в научных целях и при необходимости более подробной характеристики гриба определяют его вид.

При определении принадлежности к дрожжеподобным грибам рода Candida возникает необходимость дифференциации их с истинными дрожжами - сахаромицетами.

Дрожжи образуют аскоспоры, не имеют псевдомицелия, вертицилл, хламидоспор, ферментируют углероды через 12-20 ч, растут при оптимальной температуре 20-30° C (температурный максимум роста 35° C), размножаются множественным почкованием, непатогенны для животных.

Дрожжеподобные грибы рода Candida не имеют аскоспор, образуют псевдомицелий, вертициллы, хламидоспоры (С. albicans), ферментируют углеводы через 24-48 ч (С. tropicalis через 18-20 ч), температурный оптимум роста 37° C, максимум 43° C, почкование концевое, патогенность для животных выражена различно (наиболее патогенны С. albicans). Первые два признака являются основными при дифференциации.

Практически, чтобы исключить принадлежность грибов к дрожжам, достаточно выявить псевдомицелий, который обнаруживается в мазках из МПБ с глюкозой через 48 ч, в пределах 7 сут. Для ускорения его образования посев инкубируется при температуре 37° C одни сутки, а затем остается при комнатной температуре (обычно псевдомицелий виден через 48 ч). Быстрее и проще псевдомицелий выявляется в посевах на хламидоспор-агаре, где через 18-20 ч обнаруживаются хламидоспоры, псевдомицелий и определяется тип филаментации.

Следовательно, в условиях практической лаборатории принадлежность гриба к роду Candida устанавливается на основании морфологических и культуральных признаков - формы клеток, наличия псевдомицелия и характерных колоний. Выделение чистой культуры от больного занимает 4 сут, идентификация до рода - еще 2-7 сут. Поэтому для сокращения срока выдачи ответа пересев на бульон для выявления псевдомицелия делают непосредственно из колоний на чашках (3-и сутки от начала исследования). Это позволяет дать ответ на 5-е сутки после взятия материала от больного: "Выделены дрожжеподобные грибы рода Candida". При использовании для первичного посева кандида-агара, а для пересева хламидоспор-агара ответ выдается существенно быстрее - на 3-и сутки от начала исследования. Отрицательный ответ выдается на 5-7-й день от начала исследования.

Предварительные ответы можно получить через 1-2 сут после первичного посева - при изучении выросших на чашках колоний.

Более подробная идентификация выделенных грибов с определением их вида проводится по следующей схеме:

1. определение типа филаментации;
2. выявление хламидоспор;
3. изучение биохимических свойств - ферментации углеводов.

Для определения типа филаментации готовят блоки из картофельного или рисового агара по Н. П. Блинову. В упрощенном варианте эту работу можно выполнить так: расплавленный картофельный агар охлаждают до температуры около 60° C. Стерильной пипеткой наносят на стерильное предметное стекло около 0,5 мл такой среды, вносят в нее петлей исследуемую культуру, смешивают и покрывают стерильным покровным стеклом. Предметное стекло помещают в стерильную чашку Петри, на дне которой имеется стерильная фильтровальная бумага, пропитанная стерильной дистиллированной водой. Лучше между предметным стеклом и фильтровальной бумагой положить стерильные деревянные палочки, которые можно приготовить из спичек, удалив серу. Закрытую чашку с предметным стеклом инкубируют в термостате при 37° C в течение 48 ч, а затем микроскопируют. Если выявить филаментацию не удается, то чашку с предметным стеклом оставляют при комнатной температуре и микроскопируют препарат на 3-5-7-е сутки с момента приготовления препарата. Препараты микроскопируют сначала при малом, а затем при большом увеличении. На них выявляются тип филаментации и хламидоспоры одновременно. На одном предметном стекле можно приготовить два блока. В ходе исследования необходимо дополнительно увлажнять чашку дистиллированной водой. Аналогичным способом, но быстрее (через 18-20 ч) определяется тип филаментации и обнаруживаются хламидоспоры при посеве культуры из колоний на питательную среду хламидоспор-агар.

Можно определить тип филаментации и наличие хламидоспор без блоков: делать посев прямо на чашки с картофельным или рисовым агаром - радиально или по кругам (одновременно несколько культур), но при такой методике нужны высокая степень прозрачности среды и чашки из тонкого стекла.

Хламидоспоры выявляют обычно одновременно с изучением типов филаментации. Это крупные круглые образования, покрытые резко контурированной оболочкой, расположенные обычно на концах нитей псевдомицелия (см. главу I). Хламидоспоры лучше обнаруживаются на хламидоспор-агаре, на рисовом или картофельном агаре, особенно под покровным стеклом, где создаются менее благоприятные условия для развития грибов.

Ферментативную активность грибов определяют путем посева чистой культуры на ряд углеводов: лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, галактозу. Посевы инкубируют при 37° C, учет результатов производят через 48 ч и 7 сут. Вид гриба определяют на основании изучения совокупности признаков - морфологических, культуральных, биохимических (табл. 4).

Таблица 4. Краткие данные о морфологических, культуральных и биохимических свойствах наиболее распространенных видов грибов рода Candida
Вид гриба	Морфология			Характер роста не средах		Ферментация углеводов
	Форма клеток	Типы филаментации	Особые признаки	на плотных - колонии	на жидких	лак- тоза	глю- коза	маль- тоза	саха- роза	галак- тоза
С. albicans	Круглые или слегка овальные	Mycotorulа; Мусоtoruloides	Хламидо- споры	Гладкие, выпуклые, кремовато-белого цвета, мягкой консистенции	Рыхлый осадок, слегка мутноватый бульон	-	кг	кг	-	кг
С. tropicalis	Овальные	Mycotorula; Mycotoruloides; Mycocandida	Псевдокони- дин	Морщинистые, беловато-серого цвета	Кольцо, осадок, мутный бульон, на поверхности нежная серая пленочка, переходящая на стенки	-	кг	кг	кг	кг
С. pseudotropicalis	Мелкие овальные	Чаще Mycocandida	-	Плоские, с куполообразным центром,серого цвета, сметанообразной консистенции	Осадок, среда прозрачная	кг	кг	-	кг	кг
С. krusei	Слегка вытянутые	Mycotorula; Mycotoruloides; Mycocandida	-	Плоские, гладкие, матовые, буровато-сероватого цвета	Широкое кольцо, переходящее на стенки, мутная среда	-	кг	-	-	-
С. guilliermondii	Овальные	Blastodendrion; Мусоcandida	Нет бластоспор или их мало	Выпуклые, гладкие, блестящие, беловато- кремоватого цвета (как у С. albicans)	Осадок, cлабое пристеночное кольцо	-	кг	кг	кг	кг
Примечание. КГ — разложение до кислоты и газа.

Для более полной характеристики гриба иногда нужно убедиться в отсутствии аскоспор у выделенных грибов. Аскоспоры (споры внутри клетки в мешках) выявляются на среде Городковой: посевы выращивают при 28-30° C или при комнатной температуре. Микроскопировать мазки нужно с момента появления роста и до 2 нед. Можно посеять культуру просто на скошенный мясопептонный агар: у дрожжей аскоспоры появляются через 5-7 дней, у дрожжеподобных грибов рода Candida их нет.

Питательные среды.

1. Плотная среда Сабуро. Взять 18 г агар-агара, 10 г пептона, 40 г глюкозы, 1 л дистиллированной воды; прокипятить до расплавления агара, профильтровать через ватно-марлевый фильтр, разлить во флаконы и пробирки, стерилизовать при температуре 115-120° C в течение 15 мин.
2. Жидкая среда Сабуро. Готовится так же, но без агар-агара.
3. Среда Сабуро с добавлением антибиотиков. Добавить пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД на 1 мл среды (можно левомицетин) для подавления роста бактерий. Среда применяется при первичных посевах биоматериалов. Антибиотики добавлять перед употреблением среды.
4. Сусло-агар. Солодовое сусло развести в 2 раза водопроводной водой и добавить 18-20 г агар-агара. Стерилизовать как среду Сабуро.
5. Мясопептонный бульон (МПБ) с глюкозой. К стерильному МПБ асептично добавить стерильный раствор глюкозы из расчета конечного ее содержания в бульоне 2%. Можно добавить глюкозу с последующей стерилизацией среды при 100° C в течение 20-30 мин.
6. Кандида-агар. Выпускается НИИ питательных сред (г. Махачкала). 48 г порошка высыпать в колбу с 1 л холодной дистиллированной воды, прокипятить 1-2 мин на слабом огне, профильтровать через ватно-марлевый фильтр, вновь довести до кипения. После охлаждения до 50-60° C разлить в стерильные чашки Петри, подсушить 40-50 мин в термостате.
7. Хламидоспор-агар. Выпускается НИИ питательных сред (г. Махачкала). Среду готовят перед употреблением, так как в холодильнике она мутнеет, но если вынутую из холодильника среду подогреть, прозрачность ее восстанавливается. 30 г порошка высыпать в колбу с 1 л холодной дистиллированной воды, размешать, довести до кипения при помешивании, кипятить 1-2 мин, профильтровать через ватно-марлевый фильтр, разлить во флаконы, стерилизовать при 0,5 атм 20 мин. Сразу охладить до 50- 60° C, разлить слоем 2-3 мм на стерильные предметные стекла или в чашки Петри, подсушить в термостате 50-60 мин.
8. Углеводы для определения ферментативных свойств гриба: 10 г пептона, 10-20 г одного из углеводов (лактоза, глюкоза, мальтоза, сахароза), 5 г хлорида натрия, 10 мл индикатора Андреде, 1 л дистиллированной воды. Стерилизовать так же, как МПБ с глюкозой.
9. Картофельный агар. Берут 20 г тертого картофеля и настаивают в 1 л водопроводной воды в течение 4 ч при комнатной температуре, добавляют 20 г агар-агара, кипятят в течение 10- 15 мин, фильтруют, разливают в пробирки по 4-5 мл и стерилизуют при температуре 120° C в течение 30 мин.
10. Картофельный агар с глюкозой. Готовят так же, как картофельный агар, но берут 100 г протертого картофеля и добавляют после фильтрования среды 10 г глюкозы. Стерилизуют, как среду Сабуро.
11. Рисовый агар Блинова. Берут 20 г очищенного риса и кипятят в 1 л дистиллированной воды в течение 20-30 мин, фильтруют через бумажный фильтр и доводят фильтрат до первоначального объема дистиллированной водой, затем добавляют 20 г маннита, 10 г серина, 5 г сульфата натрия, 20 г агар-агара. Смесь кипятят до растворения агар-агара и осветляют лошадиной сывороткой (70 мл на 1 л среды) по обычным правилам. Стерилизация при температуре 110° C в течение 20 мин.
12. Среда Городковой. Это мясопептонный агар с добавлением 0,25% глюкозы; стерилизация при температуре 110° C в течение 20 мин.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие Глава I. Распространение дрожжеподобных грибов рода Candida среди здоровых лиц. Кандиданосительство. Кандидоз Пути инфицирования грибами рода Candida и краткие сведения о них Частота выделения грибов. Кандиданосительство. Факторы риска, способствующие развитию кандидоза Основные сведения о кандидозе Глава II. Оценка методов лабораторной диагностики кандидоза. Дифференциальная диагностика кандиданосительства и кандидоза Глава III. Бактериальные инфекции зева при локализации грибов рода Candida на слизистой оболочке полости рта Дифтерия Дифтерийное носительство Хронический тонзиллит Глава IV. Воспалительные заболевания дыхательных путей, протекающие в присутствии грибов рода Candida Хронический фарингит Пневмония, хронический бронхит Бронхиальная астма Туберкулез

Глава V. Острые кишечные инфекции и некоторые хронические заболевания кишечника при участии грибов рода Candida в микробных ассоциациях Дизентерия Брюшной тиф Эшерихиозы и другие острые кишечные заболевания у детей Хронический энтероколит, неспецифический язвенный колит Глава VI. Роль грибов рода Candida в формировании бактериальных осложнений при вирусном гепатите Глава VII. Значение грибов рода Candida при некоторых заболеваниях кожи и мочеполовой системы Гнойные заболевания кожи Трихомоноз, гонорея, сочетанные инфекции мочеполовой системы Глава VIII. Механизм отягощающего влияния грибов рода Candida на инфекционные заболевания негрибковой этиологии Заключение Приложение. Выделение и идентификация грибов рода Candida у больных бактериальными и другими инфекциями (практические рекомендации) Список литературы