Страница 1 2 3 4 5

всего страниц: 5

Приложение N 11 (продолжение) 5.2.4. Тест с салициловокислым натрием (салициловый тест) Микобактерии комплекса М.tuberculosis не обладают способностью утилизировать салициловокислый натрий, который оказывает на рост микобактерий туберкулеза угнетающее воздействие. Это свойство салицилата натрия используется как один из основных биохимических методов дифференциации М.tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий. Для проведения этого теста готовят среду Левенштейна-Йенсена, в состав которой до свертывания вводят салицилат натрия в количестве, позволяющем получить концентрацию препарата, равную 1000 мкг/мл. В качестве контрольной используют пробирку со стандартной средой Левенштейна-Йенсена. Указанный тест чаше всего ставят одновременно с постановкой опыта по определению лекарственной устойчивости, добавляя к набору пробирок 1 пробирку с 1000 мкг/мл салициловокислого натрия. Посев суспензии исследуемой культуры микобактерий и учет результатов теста производят одновременно с посевом на среды, содержащие противотуберкулезные препараты, и учетом лекарственной устойчивости. Микобактерии комплекса M.tuberculosis не дают роста на среде с салициловокислым натрием. При наличии лекарственной устойчивости ко всем основным противотуберкулезным препаратам необходимо убедиться, что исследуемая культура не принадлежит к нетуберкулезным микобактериям, для которых этот феномен является характерным. При этом следует иметь в виду, что видимый рост на среде с салициловокислым натрием появляется значительно позже срока, установленного для учета лекарственной устойчивости. Поэтому в таких случаях после учета результатов определения лекарственной устойчивости контрольную пробирку и пробирку с салициловокислым натрием следует сбрасывать не сразу, а лишь после окончания всех дифференцирующих тестов. 5.3. Дополнительные биохимические тесты Для принципиального отличия микобактерий комплекса M.tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий применяются вышеперечисленные в таблице 6 дополнительные биохимические тесты. Все химические вещества, используемые в этих тестах, обладают способностью подавлять рост микобактерий комплекса M.tuberculosis. Во всех тестах применяется специально приготовленная среда Левенштейна-Йенсена, содержащая соответственно: 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты или 5% натрия хлорида. В качестве контроля в каждом из тестов используется пробирка со стандартной средой Левенштейна-Йенсена. 5.3.1. Тест с паранитробензойной кислотой (PNB-тест) В лабораториях, в которых оборудование и/или отсутствие реагентов не позволяют производить постановку ниацинового и нитратредуктазного тестов, для идентификации микобактерий туберкулеза может быть использована комбинация одного или нескольких описанных выше каталазных тестов, а также определение способности к росту при 37° C на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей паранитробензойную кислоту (PNB-тест). Приготовление среды с паранитробензойной кислотой 50 мг паранитробензойной кислоты (ПНБ) хорошо растирают в ступке, добавляют 5 мл дистиллированной воды и примерно 20 капель (1,0 мл) 4% едкого натра до pH = 8. После полного растворения ПНБ добавляют 2 - 3 капли 6% соляной кислоты, доводя pH до 7,0. Полученный раствор добавляют к 95 мл предварительно профильтрованной яичной среды, получая таким образом конечную концентрацию паранитробензойной кислоты в среде, равную 500 мкг/мл. Свертывание среды производят в обычном порядке. Процедура исследования Перед проведением теста необходимо приготовить пробирки с питательной средой Левенштейна-Йенсена, содержащей паранитробензойную кислоту в концентрации 500 мкг/мл. В качестве контроля используются пробирки со стандартной средой Левенштейна-Йенсена. Произвести посев в две пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, одна из которых содержит паранитробензойную кислоту в концентрации 500 мкг/л, другая - контрольная без паранитробензойной кислоты. В процессе инкубации при 37° C пробирки исследуются на 3-й, 7-й, 14-й и 21-й день. 5.3.2. Тест с 5% хлоридом натрия Данный тест используется для дифференциации микобактерий комплекса М.tuberculosis и выполняется аналогично тесту с паранитробензойной кислотой на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 5% хлорида натрия. Метод основан на способности ряда видов нетуберкулезных микобактерий расти на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Микобактерии комплекса М.tuberculosis на этой среде не растут. 5.3.3. Пиразинамидазный тест Тест применяется как дополнительный для дифференциации М.tuberculosis от М.bovis. Тест основан на способности М.tuberculosis в течение 4-х дней дезаминировать пиразинамид до пиразиновой кислоты и аммония, что указывает на наличие пиразинамидазы. М.bovis не проявляет пиразинамидазной активности даже после 7 дней инкубации. 5.3.4. Тест с гидразидом тиофен-2-карбоксиловой кислоты (ТСН) Тест используется для дифференциации М.bovis от М.tuberculosis и других медленнорастущих микобактерий. Только М.bovis чувствительны к низким концентрациям ТСН (от 1 до 5 мкг/мл). М.tuberculosis и другие микобактерии обычно устойчивы к действию этого химического соединения. Микобактерии комплекса M.tuberculosis характеризует следующая совокупность признаков -----------------------------------------------------------------¬ ¦Медленная скорость роста (более 3-х недель). ¦ ¦Температура роста в пределах 35 - 37° C. ¦ ¦Отсутствие пигментообразования (цвет слоновой кости). ¦ ¦Выраженная кислотоустойчивая окраска. ¦ ¦Положительный ниациновый тест. ¦ ¦Положительный нитратредуктазный тест. ¦ ¦Отсутствие термостабильной каталазы (68° C). ¦ ¦Отсутствие роста на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей: ¦ ¦- 1000 мкг/мл натрия салициловокислого; ¦ ¦- 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; ¦ ¦- 5% хлорида натрия. ¦ ¦Рост в присутствии 1 - 5 мкг/мл ТСН. ¦ L----------------------------------------------------------------- VI. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ К ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ПРЕПАРАТАМ Определение спектра и степени устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам имеет важное значение для тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения, определения прогноза заболевания и проведения эпидемиологического мониторинга лекарственной устойчивости микобактерий в пределах отдельной территории, страны и мирового сообщества. Степень лекарственной устойчивости микобактерий определяется в соответствии с установленными критериями, которые зависят как от противотуберкулезной активности лекарственного препарата, так и его концентрации в очаге поражения, величины максимальной терапевтической дозы, фармакокинетики препарата и многих других факторов. В настоящее время для определения лекарственной устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам в международной практике используются следующие методы: - метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена или на среде Миддлбрука 7Н10; - метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена; - метод коэффициента резистентности; - радиометрический метод Bactec R 460. Выбор того или иного метода определяется традиционно сложившимися методическими подходами, используемыми в данной стране. Однако необходимо иметь в виду, что обязательным условием эффективного мониторинга, обеспечения эпидемиологического надзора за лекарственной устойчивостью микобактерий и распространением лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя, а также сопоставления результатов исследований и эффективности лечения в масштабах страны должен использоваться только один из предложенных унифицированных методов. В нашей стране получило распространение определение лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена. При всех методах определения лекарственной устойчивости необходимым звеном в деятельности лаборатории является обеспечение контроля качества исследований. 6.1. Виды лекарственной устойчивости Чувствительность микобактерий к противотуберкулезным препаратам определяется неспособностью штамма расти на среде, содержащей препарат, при стандартных условиях постановки опыта. Чувствительными к данному препарату считаются те штаммы микобактерий, на которые этот препарат в критической концентрации оказывает бактерицидное или бактериостатическое действие в соответствии с принятым критерием устойчивости. Устойчивость (резистентность) определяется как снижение чувствительности до такой степени, что данный штамм микобактерий способен размножаться при воздействии на него препарата в критической или более высокой концентрации. Наряду с понятиями "чувствительность" и "устойчивость" к противотуберкулезным препаратам в настоящее время используются также термины, определяющие различные аспекты лекарственной устойчивости. Так, в случае наличия лекарственной устойчивости к двум или более лекарственным препаратам данный штамм микобактерий определяется как полирезистентный. Особое место среди полирезистентных занимают микобактерии, у которых обнаруживается лекарственная устойчивость к двум основным противотуберкулезным препаратам (изониазиду и рифампицину) - штаммы, обладающие лекарственной устойчивостью одновременно к изониазиду и рифампицину, независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, обозначаются как штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (или штаммы с МЛУ). Этим штаммам уделяется особое внимание, так как лечение пациентов, у которых процесс вызван такими штаммами, представляет большие трудности. Оно является длительным, дорогостоящим и требует использования препаратов резервного ряда, многие из которых дорогостоящие и могут вызывать тяжелые побочные реакции. Кроме того, некоторые штаммы с множественной лекарственной устойчивостью обладают повышенной способностью к распространению (трансмиссивностью) и вызывают тяжелые прогрессирующие формы заболевания, нередко приводящие к неблагоприятным исходам. Наряду с перечисленными определениями различных видов спектра лекарственной устойчивости микобактерий, в международной практике принято различать первичную и приобретенную лекарственную устойчивость. Первичная лекарственная устойчивость определяется как устойчивость, обнаруженная у микобактерий, выделенных от пациента, никогда не принимавшего противотуберкулезные препараты или получавшего такое лечение менее одного месяца. В данном случае подразумевается, что больной заразился лекарственно-устойчивым штаммом микобактерий. Первичная лекарственная устойчивость характеризует состояние микобактериальной популяции, циркулирующей в данной территории, и ее показатели важны для оценки степени напряженности эпидемической ситуации. Приобретенная (вторичная) лекарственная устойчивость определяется как устойчивость микобактерий, выявленных у больного туберкулезом, получавшего лечение противотуберкулезными препаратами в течение месяца и более. Вторичная лекарственная устойчивость является косвенным показателем эффективности проводимой химиотерапии. 6.2. Критерии лекарственной устойчивости Уровень устойчивости данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (количество мкг в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение микобактерий (по числу колоний на плотных средах). Лекарственно-устойчивые микроорганизмы способны размножаться при таком содержании препарата в среде, которое оказывает на чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное воздействие. Критические концентрации. Критерии лекарственной устойчивости. Для различных препаратов установлена определенная критическая концентрация. Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на микобактерии туберкулеза в условиях макроорганизма. КРИТЕРИЕМ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ НАЗЫВАЮТ ПОКАЗАТЕЛЬ РОСТА МИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО ПУЛА, ВЫРАЖЕННЫЙ В АБСОЛЮТНЫХ (ЧИСЛО КОЕ) ИЛИ ОТНОСИТЕЛЬНЫХ ЕДИНИЦАХ (ПРОПОРЦИЯ КОЕ), НА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ, СОДЕРЖАЩЕЙ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫЙ ПРЕПАРАТ В КРИТИЧЕСКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, ПРЕВЫШЕНИЕ КОТОРОГО СЧИТАЕТСЯ НАЛИЧИЕМ ПРИЗНАКА УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ. Для метода абсолютных концентраций появление более 20 КОЕ микобактерий на питательной среде, содержащей лекарственный препарат в критической концентрации, свидетельствует о том, что данный штамм микобактерий обладает лекарственной устойчивостью. При этом необходимо иметь в виду, что объем засеваемой суспензии клеток стандартизован и соответствует 1 x 107 микробных тел. Для разных по составу питательных сред критическая концентрация одного и того же препарата различна. Значения критических концентраций существенно отличаются также при использовании разных методов определения лекарственной чувствительности. Таблица 8 КРИТИЧЕСКИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕТОДОМ АБСОЛЮТНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ НА СРЕДЕ ЛЕВЕНШТЕЙНА-ЙЕНСЕНА T-----------------------------------------T----------------------¬ ¦ Название препарата ¦Концентрация в мкг/мл ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦ Препараты основного ряда ¦ +-----------------------------------------T----------------------+ ¦Стрептомицин ¦ 10 ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦Изониазид ¦ 1 ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦Рифампицин ¦ 40 ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦Этамбутол ¦ 2 ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦ Препараты резервного ряда <*> ¦ +-----------------------------------------T----------------------+ ¦Канамицин ¦ 30 ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦Протионамид (этионамид) ¦ 30 ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦Циклосерин ¦ 30 ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦Капреомицин ¦ 30 ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦Офлоксацин ¦ 2 ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦ПАСК ¦ 1 ¦ +-----------------------------------------+----------------------+ ¦Пиразинамид ¦ 200 ¦ L-----------------------------------------+----------------------- -------------------------------- <*> Критические концентрации препаратов II ряда носят ориентировочный характер и будут окончательно установлены после дополнительных исследований. 6.3. Метод абсолютных концентраций В России для определения лекарственной устойчивости микобактерий традиционно используется метод абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена. В большинстве случаев этот метод применяется для непрямого определения лекарственной устойчивости. Непрямым методом называется метод определения лекарственной устойчивости после выделения культуры микобактерий. Он позволяет исследовать любое количество микобактерий в диагностическом материале, поскольку для определения лекарственной устойчивости используются штаммы микобактерий, предварительно выделенные на питательных средах. Так как сроки выделения возбудителя на питательных средах составляют не менее 1 - 1,5 месяцев, результаты определения лекарственной устойчивости указанным методом обычно получают не ранее чем через 2 - 2,5 месяца после посева материала. При определении лекарственной устойчивости микобактерий на плотных средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая содержится в среде, если число колоний микобактерий, выросших на одной пробирке с препаратом, не превышает 20, а посевная доза соответствует 1 x 107 микробных тел. Культура расценивается как устойчивая к данной концентрации препарата только при наличии на пробирке с этой концентрацией 20 колоний и более при обильном росте в контрольной пробирке, не содержащей лекарственного препарата. В отечественной фтизиатрической практике при определении лекарственной устойчивости не ограничиваются определением только критических концентраций. Это связано с тем, что расширенное определение уровня лекарственной устойчивости возбудителя позволяет клиницисту варьировать дозировки препаратов и лекарственные режимы, добиваясь более эффективного воздействия препаратов за счет допустимого повышения дозы и использования синергидных и аддитивных свойств различных комбинаций лекарственных препаратов. Таблица 9 КОНЦЕНТРАЦИИ ПРЕПАРАТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ МЕТОДОМ АБСОЛЮТНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ НА СРЕДЕ ЛЕВЕНШТЕЙНА-ЙЕНСЕНА T----------------------------------T-----------------------------¬ ¦ Препарат ¦ Концентрации в мкг/мл ¦ +----------------------------------+-----------------------------+ ¦ Препараты I ряда ¦ +----------------------------------T--------------T--------------+ ¦Стрептомицин ¦ 10 ¦ 25 ¦ +----------------------------------+--------------+--------------+ ¦Изониазид ¦ 1 ¦ 10 ¦ +----------------------------------+--------------+--------------+ ¦Рифампицин ¦ 40 ¦ 80 ¦ +----------------------------------+--------------+--------------+ ¦Этамбутол ¦ 2 ¦ 5 ¦ +----------------------------------+--------------+--------------+ ¦ Препараты II ряда ¦ +----------------------------------T--------------T--------------+ ¦Канамицин ¦ 30 ¦ 50 ¦ +----------------------------------+--------------+--------------+ ¦Протионамид (этионамид) ¦ 30 ¦ 50 ¦ +----------------------------------+--------------+--------------+ ¦Циклосерин ¦ 30 ¦ 50 ¦ +----------------------------------+--------------+--------------+ ¦Капреомицин ¦ 30 ¦ 50 ¦ +----------------------------------+--------------+--------------+ ¦Офлоксацин ¦ 2 ¦ 10 ¦ +----------------------------------+--------------+--------------+ ¦ПАСК ¦ 1 ¦ 5 ¦ L----------------------------------+--------------+--------------- 6.3.1. Разведение противотуберкулезных препаратов и приготовление питательных сред В питательную среду Левенштейна-Йенсена, не содержащую крахмала (крахмал адсорбирует лекарственные препараты), непосредственно перед свертыванием добавляют рабочие разведения различных противотуберкулезных препаратов. Для приготовления питательных сред с целью определения лекарственной устойчивости микобактерий должны использоваться химически чистые субстанции противотуберкулезных препаратов. ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИЗ ХИМИЧЕСКИ ЧИСТОЙ ПОРОШКОВИДНОЙ ФОРМЫ ПРЕПАРАТА РАБОЧИХ РАСТВОРОВ, СОДЕРЖАЩИХ НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ, РАСЧЕТЫ ПРОИЗВОДЯТ С УЧЕТОМ ПРОЦЕНТА АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА. Активность препарата может варьировать от одной его серии к другой серии. Сведения об активности приводятся на этикетках или упаковках лекарственных препаратов и могут быть получены от компании-изготовителя. 6.3.2. Примеры приготовления питательных сред с препаратами Для определения лекарственной чувствительности к лекарственным препаратам в лаборатории должны иметься поверенные весы, позволяющие производить взвешивание с точностью до 0,2 мг, что обеспечит точность навески препаратов с погрешностью не более +/- 1,5%. Стрептомицин Для определения лекарственной чувствительности к стрептомицину используют стрептомицина сульфат. По данным производителя активность стрептомицина сульфата составляет 750 мг в 1 г чистой субстанции. Чтобы получить исходный рабочий раствор (А), содержащий в 1 мл раствора 1 мг активной субстанции, следует: - (А) приготовить навеску 20 мг стрептомицина сульфата с точностью до 0,2 мг, что будет соответствовать 15 мг активного начала, и растворить в 15 мл стерильной дистиллированной воды - 1 мг/мл = 1000 мкг/мл. Приготовление питательной среды: Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (40 пробирок по 5 мл) на каждое разведение препарата необходимо: В две стерильные промаркированные колбы (N 1 - 10 мкг/мл, N 2 - 25 мкг/мл) стерильной пипеткой налить последовательно: - в N 1 - 198 мл среды + 2 мл раствора (А) = 10 мкг/мл; - в N 2 - 195 мл среды + 5 мл раствора (А) = 25 мкг/мл. Желательно вначале налить в колбы расчетное количество раствора А, а затем расчетное количество питательной среды. Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в наклонном положении в аппарат для свертывания, добиваясь равномерной величины косяков (примерно 8 - 10 см), и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке. Изониазид Активность препарата: в 1 г чистой субстанции содержится 990 мг активного начала = 99%. Приготовить навеску 20 мг изониазида: - (А) в 20 мл стерильной дистиллированной воды растворить 20 мг изониазида - 1 мг/мл - 1000 мкг/мл; - (Б) к 9 мл стерильной дистиллированной воды добавить 1 мл раствора (А) = 100 мкг/мл. Приготовление питательной среды: Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл x 40) на каждое разведение препарата необходимо: В две стерильные промаркированные колбы (N 1 - 1 мкг/мл, N 2 - 10 мкг/мл) стерильной пипеткой налить последовательно: - в N 1 - 198 мл среды + 2 мл раствора (Б) = 1 мкг/мл; - в N 2 - 198 мл среды + 2 мл раствора (А) = 10 мкг/мл. Желательно вначале налить в колбы расчетное количество раствора Б или А, а затем расчетное количество питательной среды. Перемешивание, разливание и коагулирование производят, как и в предыдущем случае. Рифампицин Активность препарата: в 1 г чистой субстанции - 970 мг активного начала = 97%. Взвесить 30 мг порошковидной формы чистой субстанции рифампицина. Рифампицин нерастворим в дистиллированной в воде, поэтому можно предложить нижеприведенную последовательность приготовления растворов: Приготовление питательной среды: На 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл x 40): Приготовить навеску 30 мг и перенести ее в стерильную пробирку N 1. (1) 30 мг RIF + 2,0 мл этанола - 14550 мкг/мл. Подогреть до Т 35 - 40° C на водяной бане. Затем, используя стерильные пробирки: (А) 2,0 мл раствора (1) + 5,2 H2O - 4000 мкг/мл; (Б) 2,5 мл раствора (А) + 2,5 мл H2O - 2000 мкг/мл. Маркируют стерильные колбы N 1 "40 мкг/мл", N 2 "80 мкг/мл": - в N 1 - 4 мл (Б) + 196 мл среды - 40 мкг/мл; - в N 2 - 4 мл (А) + 196 мл среды - 80 мкг/мл. Для ускорения полного растворения препарата допустимо легкое подогревание на водяной бане до 35 - 40° C. Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество растворов А или Б, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды. Содержимое колб N 1 и N 2 тщательно перемешать круговыми движениями. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в наклонном положении в аппарат для свертывания, добиваясь равномерной величины косяков (примерно 8 - 10 см), и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке. Этамбутол Активность препарата: в 1 г чистой субстанции - 740 мг активного начала. Для определения лекарственной устойчивости используется этамбутол дигидрохлорид. (А) приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества и растворить ее в 14,8 мл стерильной дистиллированной воды - 1 мг/мл = 1000 мкг/мл. (Б) к 8 мл стерильной дистиллированной воды добавить 2 мл раствора (А) - 200 мкг/мл. Приготовление питательной среды: Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл x 40) на каждое разведение препарата необходимо: В две стерильные промаркированные колбы (N 1 "2 мкг/мл", N 2 "5 мкг/мл") стерильной пипеткой налить последовательно: - в N 1 - 198 мл среды + 2 мл раствора (Б) = 2 мкг/мл; - в N 2 - 195 мл среды + 5 мл раствора (Б) = 5 мкг/мл. Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора Б, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды. Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в аппарат для свертывания и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке. Канамицин Активность препарата: в 1 г чистой субстанции канамицина моносульфата колеблется от 750 до 823 мг активного начала. Для расчета возьмем величину активности, равную 750 мкг в 1 мг. Чтобы получить исходный рабочий раствор (А), содержащий в 1 мл раствора 2000 мкг активной субстанции, следует: (А) приготовить навеску 30 мг порошковидной формы канамицина моносульфата = 22,5 мг активного начала и растворить в 11,3 мл стерильной дистиллированной воды - 2 мкг/мл = 2000 кг/мл. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (40 пробирок по 5 мл) на каждое разведение препарата необходимо: В две стерильные промаркированные колбы (N 1 - 30 мкг/мл, N 2 - 50 мкг/мл) стерильной пипеткой налить последовательно: - в N 1 - 197 мл среды + 3 мл раствора (А) = 30 мкг/мл; - в N 2 - 195 мл среды + 5 мл раствора (А) = 50 мкг/мл. Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора А, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды. Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в наклонном положении в аппарат для свертывания, добиваясь равномерной величины косяков (примерно 8 - 10 см), и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке. Протионамид (этионамид) Оба препарата плохо растворяются в воде. Активность препарата: в 1 г чистой субстанции - 990 мг активного начала. Препарат нерастворим в дистиллированной воде. (А) приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества и растворить в 3 мл ректифицированного этилового спирта 96° или диметил-сульфоксида. Добавить к раствору 6,9 мл стерильной дистиллированной воды - 2000 мкг/мл. Приготовление питательной среды: Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл x 40) на каждое разведение препарата необходимо: В две стерильные промаркированные колбы (N 1 "30 мкг/мл", N 2 "50 мкг/мл") стерильной пипеткой налить последовательно: - в N 1 - 197 мл среды + 3 мл раствора (А) - 30 мкг/мл; - в N 2 - 195 мл среды + 5 мл раствора (А) - 50 мкг/мл. Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора А, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды. Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в аппарат для свертывания и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке. Капреомицин Содержание активного начала в препарате - 840 мг в 1 г. РАСТВОРЫ КАПРЕОМИЦИНА ОТЛИЧАЮТСЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬЮ, ПОЭТОМУ ИХ ГОТОВЯТ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ПРИГОТОВЛЕНИЕМ СРЕД. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл x 40) можно воспользоваться следующей схемой: Приготовить навеску 20 мг вещества. (А) 20 мг кампреомицина + 8,4 мл H2O - 2000 мкг/мл. Колбы N 1 "30 мкг/мл", N 2 "50 мкг/мл": - в N 1 - 3 мл (А) + 197 мл среды - 30 мкг/мл; - в N 2 - 5 мл (А) + 195 мл среды - 50 мкг/мл. Желательно вначале налить в колбы расчетное количество раствора А, а затем расчетное количество питательной среды. Перемешивание, разливание и коагулирование производят, как и в предыдущем случае. Циклосерин (D-cycloserin) В 1 г препарата 980 мг активного начала. Растворы циклосерина отличаются нестабильностью, поэтому их готовят непосредственно перед приготовлением сред. (А) приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества и растворить в 9,9 мл стерильной дистиллированной воды - 2 мг/мл = 2000 мкг/мл. Приготовление питательной среды: Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл x 40) на каждое разведение препарата необходимо: В две стерильные промаркированные колбы (N 1 - 30 мкг/мл, N 2 - 50 мкг/мл) стерильной пипеткой налить последовательно: - в N 1 - 197 мл среды + 3 мл раствора (А) - 30 мкг/мл; - в N 2 - 195 мл среды + 5 мл раствора (А) - 50 мкг/мл. Желательно вначале налить в колбы расчетное количество раствора А, а затем расчетное количество питательной среды. Перемешивание, разливание и коагулирование производят, как и в предыдущем случае. ПАСК Активность препарата: в 1 г чистой субстанции - 877,2 мг активного начала. Для примера расчета возьмем среднюю величину активности, равную 880 мг в 1 мг. Чтобы получить исходный рабочий раствор (А), содержащий в 1 мл раствора 1,0 мг активной субстанции, следует: (А) взвесить на электронных или аналитических весах 20 мг порошковидной формы ПАСК = 17,6 мг активного начала и растворить в 17,6 мл стерильной дистиллированной воды - 1 мг/мл = 1000 мкг/мл; (Б) к 18 мл стерильной дистиллированной воды добавить 2 мл раствора А - 100 мкг/мл. Приготовление питательной среды: Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (40 пробирок по 5 мл) на каждое разведение препарата необходимо: В две стерильные промаркированные колбы (N 1 "1 мкг/мл", N 2 "5 мкг/мл") стерильной пипеткой налить последовательно: - в N 1 - 198 мл среды + 2 мл раствора (Б) - 1 мкг/мл; - в N 2 - 190 мл среды + 10 мл раствора (Б) - 5 мкг/мл. Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора Б, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды. Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в аппарат для свертывания и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке. Офлоксацин Активность препарата: в 1 г чистой субстанции - 1000 мг активного начала. Офлоксацин нерастворим в дистиллированной воде, для его растворения применяется 0,1 N раствор NaOH. Для этого: к навеске 0,4 г NaOH добавить 100 мл стерильной дистиллированной воды = 0,1 N NaOH; (А) приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества и растворить ее в 20 мл 0,1 N раствора NaOH - 1 мг/мл = 1000 мкг/мл; (Б) к 12 мл стерильной дистиллированной воды добавить 3 мл раствора (А) - 200 мкг/мл. Приготовление питательной среды: Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл x 40) на каждое разведение препарата необходимо: В две стерильные промаркированные колбы (N 1 "2 мкг/мл", N 2 "10 мкг/мл") стерильной пипеткой налить последовательно: - в N 1 - 198 мл среды + 2 мл раствора (Б) = 2 мкг/мл; - в N 2 - 190 мл среды + 10 мл раствора (Б) = 10 мкг/мл. Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора Б, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды. Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в аппарат для свертывания и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке. Пиразинамид Пиразинамид является препаратом, входящим во все схемы лечения, и обладает бактерицидной активностью в отношении внутриклеточно расположенных микобактерий. Особенностью препарата является его высокая противотуберкулезная активность при сниженных значениях кислотности среды (pH ~= 6,0). В то же время для культивирования микобактерий туберкулеза на плотных яичных средах оптимальным является значение кислотности, близкое к нейтральному. Эти обстоятельства не позволяют использовать стандартные методики для определения лекарственной устойчивости к пиразинамиду на плотных яичных питательных средах. Постановка опытов по определению лекарственной устойчивости Непосредственно перед постановкой опыта по определению лекарственной устойчивости необходимо убедиться в том, что отобранные для исследования культуры микобактерий не загрязнены посторонней микрофлорой. Для этого необходимо: - провести визуальную (макроскопическую) оценку каждой отобранной культуры, обращая внимание на массивность и характер роста, однородность колоний, отсутствие загрязнения, цвет питательной среды; - провести микроскопию окрашенного по Ziehl-Neelsen мазка из отобранной культуры с целью определения чистоты культуры и степени ее кислотоустойчивости. Проверенные и отобранные для постановки опыта культуры микобактерий расставить в штативе в порядке номеров. При любом методе определения чувствительности микобактерий к противотуберкулезным препаратам каждую серию приготовленной питательной среды с препаратами необходимо проверить, засевая на нее заведомо чувствительную культуру микобактерий туберкулеза. Для контроля можно пользоваться чувствительным штаммом H37Rv или любой другой многократно проверенной культурой микобактерий туберкулеза, чувствительной ко всем испытуемым противотуберкулезным препаратам. Контрольная культура засевается так же, как и испытуемые. Если среда с препаратами приготовлена правильно, то контрольная культура не должна расти при тех концентрациях препаратов, при которых не растут чувствительные к данному препарату штаммы. Появление роста контрольного штамма в пробирке с препаратом указывает на то, что при приготовлении среды с препаратами допущена ошибка, или на то, что неправильно приготовлена бактериальная суспензия. При подготовке процедуры исследования необходимо предварительно: - занести номера отобранных культур в рабочий журнал; - расставить в штативы наборы питательных сред с препаратами для каждой культуры, контрольную пробирку (со средой без препаратов) и пробирку со средой, содержащей салицилат натрия - 1000 мкг/мл; - на каждой пробирке со средой написать номер культуры, название препарата и его концентрацию. Пример: -----------------------------------------------------------------¬ ¦ Надпись на пробирке ¦ +----------------------T---------T---------T----------T----------+ ¦N культуры по журналу ¦203 ¦203 ¦203 ¦203 ¦ ¦регистрации ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Препарат ¦К ¦NaS ¦Sm ¦Sm ¦ ¦Концентрация ¦ ¦ ¦10 ¦25 ¦ +----------------------+---------+---------+----------+----------+ ¦Пояснения ¦Контроль ¦Натрия ¦Стрептоми-¦Стрептоми-¦ ¦ ¦ ¦салицилат¦цин 10 ¦цин 25 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мкг/мл ¦мкг/мл ¦ L----------------------+---------+---------+----------+----------- Приготовление бактериальной суспензии Выросшую на плотной питательной среде культуру (обязательно несколько колоний) снимают платиновой лопаточкой и помещают в стерильную фарфоровую ступку или толстостенную стеклянную пробирку. В случае наличия роста на 2 пробирках с разными питательными средами (Левенштейна-Йенсена и Финна-II) для приготовления суспензии культуру снимают с обеих пробирок. Тщательно растирают пестиком или стеклянной палочкой, постепенно добавляя по каплям стерильный физиологический раствор. Полученную суспензию отбирают пастеровской пипеткой и переносят в стерильную пробирку, диаметр которой соответствует диаметру пробирки с оптическим стандартом мутности. Для осаждения клеточных конгломератов и стеклянных или фарфоровых частиц густую исходную суспензию клеток отстаивают в течение 15 минут и переносят в новую пробирку. После этого суспензию культуры стандартизуют по оптическому стандарту мутности N 5 (500 млн. микробных тел в 1 мл). Затем разводят в 10 раз стерильным физиологическим раствором. Для этого следует заранее приготовить ряд пробирок по числу исследуемых культур микобактерий и подписать на них номера исследуемых культур. В каждую пробирку налить по 9 мл стерильного физиологического раствора. После приготовления суспензий всех взятых в опыт культур микобактерий и каждую из приготовленных пробирок внести стерильной пипеткой по 1 мл суспензии микобактерий, соответствующей стандарту N 5. Получают суспензии с содержанием клеток, соответствующим 5 x 107 микробных тел. Посев на среды с лекарственными препаратами производить из этих суспензий. Процедура исследования: - полученную бактериальную суспензию набрать в мерную пипетку объемом 1,0 или 2,0 мл; - внести по 0,2 мл суспензии в верхнюю 1/3 косяка во все пробирки с питательной средой, приготовленной для определения устойчивости культуры данного номера, тщательно сверяя номер культуры засеваемой суспензии с номерами, написанными на пробирках. Во избежание ошибок все пробирки, подготовленные для засева одной культуры, следует расставлять в одном ряду штатива; - каждую засеянную суспензией пробирку закрыть ватно-марлевой или дренированной силиконовой пробкой и поставить в вертикальный штатив с тем, чтобы суспензия равномерно распределялась по поверхности косяка среды к дну пробирки; - использованную для засева пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором; - по завершении засева всех суспензий засеянные пробирки переместить в горизонтальные штативы - "диваны" и поместить в термостат при температуре 37° C; при этом поверхность косяка питательной среды должна находиться в горизонтальной плоскости, а наклон штатива должен исключить смачивание пробки материалом засева; - по истечении 2 - 3 суток инкубации ватно-марлевые пробки заменить резиновыми или недренированными силиконовыми; - после этого засеянные пробирки перевести в вертикальное положение; - инкубирование проводить в течение 3 - 4 недель при обязательном еженедельном просмотре. Оценка результатов Результат определения лекарственной устойчивости учитывают на 21 день после посева. При скудном росте в контрольной пробирке все пробирки с препаратами оставляют еще на 1 - 2 недели в термостате до получения выраженного роста в контроле, после чего выдают окончательный ответ. Культуру считают чувствительной к данной концентрации препарата, если в пробирке со средой, содержащей препарат, выросло менее 20 колоний при обильном росте в контрольной пробирке. Культура считается устойчивой к той концентрации препарата, которая содержится в данной пробирке, если в пробирке со средой выросло более 20 колоний при обильном росте в контроле. 6.4. Альтернативные методы определения лекарственной устойчивости микобактерий Существует несколько методов определения лекарственной устойчивости микобактерий. Практически все они основаны на культивировании микобактерий на плотных (яичные или агаровые) или жидких питательных средах и осуществляются как прямой или непрямой метод определения лекарственной устойчивости (см. выше). При прямом методе на ряд питательных сред, содержащих и не содержащих определенные концентрации лекарственных препаратов, засевается обработанный гомогенизирующими и обеззараживающими средствами обогащенный при центрифугировании осадок диагностического материала. При непрямом методе на ряд питательных сред, содержащих и не содержащих определенные концентрации лекарственных препаратов, засевается суспензия чистой культуры микобактерий, выращенной на плотной яичной или агаровой среде. Аналогичным образом может исследоваться культура, выращенная на жидкой питательной среде (7Н9 бульон) и соответствующим образом дозированная. Как указывалось выше, в международной практике используются преимущественно 4 метода: - метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена или на среде Миддлбрука 7Н10; - метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена; - метод коэффициента резистентности; - радиометрический метод Bactec R 460. 6.4.1. Прямой метод абсолютных концентраций Наряду с непрямым определением лекарственной устойчивости микобактерий в ряде случаев при наличии у больного массивного бактериовыделения (значительное или умеренное количество микобактерий - см. таблицу 3), выявляемого при микроскопическом исследовании мазка нативного материала или осадка, можно использовать метод прямого определения лекарственной устойчивости. В таких случаях производится прямой посев осадка обработанного детергентами диагностического материала на набор питательных сред с противотуберкулезными препаратами. Параллельно, чтобы не упустить возможность выделения культуры микобактерий, обязательно производится посев материала на стандартные питательные среды. Метод прямого определения лекарственной устойчивости может (в случае положительного результата) значительно ускорить получение ответа о лекарственной устойчивости возбудителя. Однако следует иметь в виду, что при его выполнении (в отличие от непрямого метода) производится недозированный засев микобактерий, что значительно затрудняет интерпретацию результатов. 6.4.2. Метод пропорций Метод основан на сравнении числа микобактерий выделенной культуры, выросших в отсутствии препарата и в его присутствии в критических концентрациях. Для этого приготовленную, как описано выше, суспензию микобактерий, содержащую 1 мг/мл влажного веса микобактерий, разводят до концентрации 10-4 и 10-6. Оба разведения суспензии засевают на питательную среду без препарата и на набор сред с разными препаратами. Если на среде с препаратом вырастают колонии, составляющие более 1% от числа выросших на среде без препарата, культура считается устойчивой к данному препарату. Если количество КОЕ, устойчивых к данному препарату, менее 1%, культура считается чувствительной. 6.4.3. Метод коэффициента резистентности Этот метод основан на определении соотношения минимальной ингибирующей концентрации (МИК), определяемой для данного штамма конкретного больного, к МИК лекарственно-чувствительного стандартного штамма H37Rv, испытываемых в одном и том же эксперименте. В данном случае штамм H37Rv используется не для контроля опыта, а для определения возможных вариаций при постановке теста. С этой точки зрения данный метод является наиболее точным из трех вышеперечисленных, однако в силу необходимости использовать большое количество пробирок с питательной средой он является и наиболее дорогим. Последнее обстоятельство резко ограничивает его применение. Кроме описанных выше классических методов культивирования микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах, в настоящее время нашли свое применение следующие системы культуральной диагностики микобактерий и определения лекарственной устойчивости. Полуавтоматизированная радиометрическая система для выявления микобактерий в диагностическом материале и определения лекарственной устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. Для роста микобактерий в системе используются флаконы с жидкой питательной средой, которая представляет собой обогащенную бульонную основу, содержащую C14 - меченый субстрат. По мере роста микобактерий утилизируют меченый субстрат и выделяют радиоактивный углекислый газ C14O2 в пространство над средой во флаконе. В процессе тестирования газ автоматически забирается из флакона, уровень радиоактивности измеряется и регистрируется в виде индекса роста по шкале от 0 до 999. Результат посева считается положительным, если индекс роста превышает заданный порог. Ежедневное изменение индекса роста пропорционально степени роста микобактерий туберкулеза в среде. Наличие роста микобактерий может быть зафиксировано начиная с 4 - 5 суток от момента посева, учет результатов производят в течение 6 недель. Для выделения микобактерий и определения лекарственной устойчивости может быть использована система с индикацией роста по флюоресценции в ультрафиолетовом свете. Пробирки с индикатором роста содержат модифицированный бульон. В пробирки с питательной средой вносят обогатитель и смесь антибиотиков, подавляющую рост посторонней микрофлоры. Встроенный в силикон дна пробирок флюоресцентный компонент чувствителен к присутствию кислорода, растворенного в бульоне. Высокие начальные концентрации растворенного кислорода гасят эмиссию этого вещества, и регистрируется очень низкий уровень флюоресценции. Позднее активно размножающиеся микобактерии поглощают кислород, что позволяет наблюдать более интенсивную флюоресценцию при использовании ультрафиолетового трансиллюминатора. Рост также может быть зафиксирован по наличию негомогенной замутненности - мелких зерен или хлопьев в культуральной среде. Учет результатов производится в течение 8-ми недель от момента посева. Для определения лекарственной устойчивости требуется от 3-х до 14-ти дней. ВО ВСЕХ СЛУЧАЯХ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ АНАЛИЗА ДОЛЖЕН ОБЯЗАТЕЛЬНО ПОДТВЕРЖДАТЬСЯ ПРИ КОНТРОЛЬНОМ МИКРОСКОПИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ НА НАЛИЧИЕ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ БАКТЕРИЙ И ОТСУТСТВИЕ РОСТА ЗАГРЯЗНЯЮЩЕЙ МИКРОФЛОРЫ. Метод, основанный на технологии колориметрического детектирования продукции CO2 как продукта метаболизма субстратов среды развивающимися в ней микроорганизмами. Он обеспечивает уровень чувствительности, ранее достижимый только с помощью радиометрических методик, при высоком уровне безопасности, сокращении времени анализа и трудозатрат. Система включает флаконы с питательной средой и реагенты, детекторно-инкубационные модули и компьютерную систему учета. В системе используется питательная среда с добавками факторов роста. Система совмещает 3 функции: выделение микроорганизмов из крови; выделение микобактерий из различного диагностического материала; проверка стерильности. Последняя разработка, используемая для определения лекарственной чувствительности микобактерий к критическим концентрациям 5 противотуберкулезных препаратов (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол и пиразинамид), основана на сочетании агарового метода пропорций с радиометрическими методами, использующими жидкие питательные среды.

Страница 1 2 3 4 5

всего страниц: 5

Возврат на первую страницу приказа